功能核酸用于環(huán)境及活細胞內(nèi)金屬離子的傳感與成像研究.pdf

1、金屬元素在整個生命體系中有雙重作用，一方面能維持動植物的生命活動，另一方面也可能危害其健康。因此，研究環(huán)境中及生物體內(nèi)的金屬離子含量與分布，并對其進行有效地檢測，對于保護環(huán)境與人類健康有積極意義。功能核酸是指具有特定生物功能，一般指能高特異性結(jié)合特定目標物或具有某些催化功能的核酸分子。功能核酸探針在傳感方面具有一些獨特的優(yōu)勢:功能核酸可以通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化法(SELEX)篩選獲得，理論上任何目標物均可篩到其對應的功能核酸;已經(jīng)篩到

2、的功能核酸可以通過合成獲得，適用于大批量生產(chǎn);一些功能核酸，如左旋核酸(L-DNA)在生理環(huán)境下更穩(wěn)定，抗酶切降解效果更好，為活體金屬離子檢測提供了可行性;最后，功能核酸可以經(jīng)歷多次變性復性而不改變其活性，更易保存，減少了設(shè)備消耗。更重要的是，一些功能核酸對金屬離子表現(xiàn)出高度特異性，且響應信號與金屬離子含量相關(guān)，這為簡單、方便、有效地檢測金屬離子提供了可能性。因此，利用功能核酸的優(yōu)點，我們設(shè)計了一系列的生物傳感器用于檢測環(huán)境和生物體內(nèi)金

3、屬離子。
　　在第二章中，我們構(gòu)建了一種基于鉀離子傳感寡核苷酸(Potassium SensingOligonucleotide，簡稱PSO)的生物傳感器。首先用修飾有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，簡稱FRET)報告基團對的DNA鏈來優(yōu)化PSO的終端，以獲取更高的靈敏度，然后用DNA合成儀將二酰基脂質(zhì)組裝到PSO鏈上。在有鉀離子出現(xiàn)時，形成的G-四聚體構(gòu)型會使產(chǎn)生F

4、RET效應的兩種熒光基團(FAM和TAMRA)對靠近，從而導致FRET效率發(fā)生改變。此外，隨著K+濃度的變化，熒光強度比率也是可逆的。基于這個實驗方案，我們在細胞膜上組裝了該傳感器，并第一次將其用于實時檢測細胞微環(huán)境中K+濃度的動態(tài)變化。
　　在第三章中，我們構(gòu)造了一種在均相溶液和活性細胞中的L型凝血酶結(jié)合適配體（L-type Thrombin Binding Aptame，簡稱L-TBA）K+傳感器，通過用可預測的L-TBA的優(yōu)

5、點，演示基于L-TBA的K+傳感器克服了天然D-PSO的缺陷，從而在活性細胞內(nèi)實現(xiàn)K+成像并且表現(xiàn)出精確，安全和生物正交PSO的優(yōu)點。
　　在第四章中，我們基于Pb2+ DNAzymes，采用已報到的D-DNAzyme序列，根據(jù)L-DNAzyme與D-DNAzyme在存在非手性金屬離子輔因子時有類似的催化活性，但在生物樣品中，L-DNAzyme還有額外的生物穩(wěn)定性的優(yōu)點，設(shè)計了L-DNAzyme識別單元的生物傳感器并將其用在環(huán)境水