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文檔簡介
1、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子核酸酶(transcription activator-like effectornucleases,TALENs)是繼鋅指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)之后的第二代人工核酸酶技術(shù)。因TALENs的DNA結(jié)合域——轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子(transcription activator-like effector,TALE)不具有上下文效應(yīng),且脫靶效應(yīng)(off-target effects)遠(yuǎn)較Z
2、FNs低,便于設(shè)計(jì)和應(yīng)用,取得較ZFNs更廣闊的應(yīng)用空間。與CRISPR(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)技術(shù)相比,TALENs構(gòu)建較為復(fù)雜,但因其穩(wěn)定性好且脫靶效率低,顯得略勝一籌。本研究旨在優(yōu)化TALENs在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),包括對TALENs模塊組裝方法(unit assembly,UA)和線粒體內(nèi)的表達(dá)效率的優(yōu)化。
在對TALENs模塊組裝方
3、法的優(yōu)化方面,本研究提供了一種新型的TALENs模塊組裝法及活性鑒定方法。利用TALE-NT2.0在線工具在線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)上設(shè)計(jì)TALENs識別位點(diǎn)和剪切位點(diǎn),借助pEGFP-N1質(zhì)粒將該段靶序列隨機(jī)整合于HEK293F核基因組中,構(gòu)建HEK293F-T1細(xì)胞系,用于TALENs活性鑒定。依據(jù)TALE自然單元模塊序列,設(shè)計(jì)出一種新型的人工TALE偏單元;根據(jù)TALENs識別位點(diǎn),選取相應(yīng)一
4、單元模塊,利用UA法組裝;并設(shè)計(jì)出含有相應(yīng)雙酶切位點(diǎn)的TALE串聯(lián)模塊序列和TALENs載體序列,定向連接后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293F-T1細(xì)胞系。結(jié)果顯示,新型模塊組裝法定向組裝TALE模塊,克隆效率高且瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后可看到清晰的套峰。
在對TALENs線粒體內(nèi)表達(dá)效率的優(yōu)化方面,本研究提供了一種基于TALENs的mtDNA編輯工具。利用能跨膜進(jìn)入線粒體的線粒體靶向TALENs(mitochondria-targeted TALEN
5、s,mtTALENs)表達(dá)載體,誘導(dǎo)mtTALENs定位于線粒體并進(jìn)行mtDNA編輯。將TALENs的核定位信號序列(nuclear localization signal,NLS)替換為線粒體前導(dǎo)肽序列(mitochondrial targeting sequence,MTS),構(gòu)建mtTALENs(MTS),并添加了出核信號肽序列(nuclear export signal,NES),構(gòu)建mtTALENs(MTS+NES)。通過細(xì)胞
6、免疫熒光技術(shù)檢測mtTALENs與線粒體共定位情況;通過粗提線粒體,檢測線粒體內(nèi)mtTALENs的含量;觀察測序峰圖中的套峰,來檢測mtTALENs對核基因組的干擾。結(jié)果顯示,帶有MTS和NES的mtTALENs與只帶有MTS的mtTALENs相比,二者均可以定位于線粒體,但前者效率較高,且對核基因組干擾較小。
總而言之,新型模塊組裝方法提高了TALENs構(gòu)建過程中的克隆效率,并且不受末位0.5模塊的重復(fù)可變雙氨基酸殘基(re
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