反義千年桐油酸脫氫酶基因在產(chǎn)油真菌少根根霉中的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、開(kāi)發(fā)微生物油脂是未來(lái)發(fā)展生物柴油產(chǎn)業(yè)的新途徑。然而微生物油脂的成分較為復(fù)雜，難以滿足生物柴油對(duì)單不飽和脂肪酸的要求?！?2脂肪酸脫飽和酶（又稱油酸脫氫酶，簡(jiǎn)稱FAD2）是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)單不飽和脂肪酸向多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶之一，它催化油酸18：1（△9）脫氫形成亞油酸18：2（△9，12）。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，反義FAD2基因在油料作物脂肪酸調(diào)控基因工程中得到廣泛應(yīng)用，獲得了油酸含量很高的轉(zhuǎn)基因玉米（Zea mays）、大

2、豆（Glycine max）、花生（Arachis hypogaea）、油菜（Brassica campestris）等。然而，該技術(shù)在產(chǎn)油真菌中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道，這是一個(gè)全新的研究方向，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（AtMT）較之傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，具有操作簡(jiǎn)便、遺傳穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室已從木本油料樹(shù)種千年桐（Vernicia montana）中克隆到油酸脫氫酶基因（VeFAD2），我們?cè)O(shè)想運(yùn)用

3、 AtMT法將來(lái)自于植物的反義 VeFAD2基因?qū)氘a(chǎn)油真菌中，期望通過(guò)基因工程手段調(diào)控真菌的脂肪酸代謝，獲得高油酸、低亞油酸含量的轉(zhuǎn)基因工程真菌。
　　本研究通過(guò)抗生素濃度試驗(yàn)：挑選產(chǎn)油真菌少根根霉（Rhizopus arrhizus）和深黃被孢霉(Mortierella isabellina)作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料；確定卡那霉素篩選劑的作用濃度為300-500 ug/ml；選擇頭孢呋辛鈉作為抑菌劑，作用濃度為150ug/ml。

4、采用凍融法構(gòu)建了含有VeFAD2基因反義表達(dá)載體pBI121-fad2的根癌農(nóng)桿菌AGL-1工程菌株。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對(duì)絲狀真菌少根根霉和深黃被孢霉進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中對(duì)少根根霉的轉(zhuǎn)化獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，從保存的12株轉(zhuǎn)化子中，隨機(jī)選取5個(gè)，進(jìn)行PCR-Southern雜交鑒定，均出現(xiàn)雜交信號(hào)，表明目的基因已整合到這些菌株的基因組中。轉(zhuǎn)基因菌株在非選擇培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接5代后還能在選擇培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，其抗卡那霉素性狀依然可以穩(wěn)定遺傳。
　

5、　本文對(duì)根癌農(nóng)桿菌菌株類型、農(nóng)桿菌初始菌液量、共培養(yǎng)時(shí)間、乙酰丁香酮（acetosyingone，AS）作用時(shí)期與作用濃度等影響少根根霉遺傳轉(zhuǎn)化的幾個(gè)關(guān)鍵因子進(jìn)行研究，結(jié)果表明：根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105和AGL-1都適用于少根根霉的轉(zhuǎn)化，且后者的轉(zhuǎn)化效率高于前者；適宜的農(nóng)桿菌初始菌液量為50-100ul；共培養(yǎng)時(shí)間為24h，既能獲得轉(zhuǎn)化子又降低了假陽(yáng)性率；對(duì)于農(nóng)桿菌EHA105，在共培養(yǎng)階段不能缺少AS的誘導(dǎo)， 在預(yù)培養(yǎng)時(shí)期

6、加入200 umol/L AS、共培養(yǎng)時(shí)期增加AS濃度到400umol/L及以上都有利于提高轉(zhuǎn)化效率。另外，本文還改進(jìn)了試驗(yàn)操作中的共培養(yǎng)時(shí)期涂板環(huán)節(jié)和轉(zhuǎn)化子篩選培養(yǎng)環(huán)節(jié)：通過(guò)稀釋菌液的方法控制涂板量，解決了農(nóng)桿菌污染問(wèn)題；對(duì)篩選培養(yǎng)基加入方式的改進(jìn)，獲得了2個(gè)少根根霉單克隆陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
　　本文通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)了反義 VeFAD2基因?qū)Ξa(chǎn)油真菌少根根霉的遺傳轉(zhuǎn)化并獲得轉(zhuǎn)基因菌株；對(duì)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，構(gòu)建了一套經(jīng)由根癌農(nóng)桿菌