簡(jiǎn)介:傳統(tǒng)的診斷,1、問(wèn)、望、聽、觸經(jīng)驗(yàn)型判斷的方法。2、化驗(yàn)/檢驗(yàn)細(xì)胞、組織、大分子、小分子、酶、代謝物;微生物、免疫學(xué)、生物化學(xué)、病理學(xué)等。3、影像學(xué)X線、B超、CT、核磁共振、內(nèi)窺鏡等。4、特殊檢查染色體檢查、肌電/腦電/心電、骨密度、原子吸收光譜等。,隨著技術(shù)水平的發(fā)展,這些診斷方法也在不斷的提高和完善,在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中發(fā)揮了巨大的作用。并還將有更先進(jìn)的方法問(wèn)世。但這些方法大多存在一個(gè)無(wú)法克服的缺陷不可預(yù)先診斷。,隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展,越來(lái)越多的證據(jù)表明,絕大多數(shù)疾病的發(fā)生和發(fā)展都與患者的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能改變有關(guān),所以遺傳物質(zhì)的檢查越來(lái)越顯得必要?;蛟\斷的定義應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能變化而作出的或輔助臨床診斷的技術(shù),稱為基因診斷。,,,基因診斷具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、費(fèi)用低,并對(duì)許多疾病特別是遺傳性疾病做出預(yù)先診斷的優(yōu)點(diǎn)。它是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ脑\斷方法。由于基因診斷發(fā)展的時(shí)間不長(zhǎng),人們對(duì)于基因,特別是致病基因的了解還有許多空白,因此許多疾病的診斷還主要依靠其他方法。此外,基因診斷的發(fā)展并非取代和拋棄其他方法,而是相互補(bǔ)充,共同發(fā)展。,長(zhǎng)期以來(lái),單基因遺傳病的診斷主要靠臨床觀察和一系列生化檢查,但生化學(xué)檢查要求有相應(yīng)基因表達(dá)產(chǎn)物的體液或細(xì)胞,并對(duì)基因產(chǎn)物或代謝異常機(jī)理有所了解。但對(duì)絕大多數(shù)遺傳病而言,目前還遠(yuǎn)未達(dá)到這種認(rèn)識(shí)。,診斷方法的變更,理想的診斷方法是對(duì)患者基因或DNA本身直接進(jìn)行分析,因?yàn)檫@種分析擺脫了上述各種限制。機(jī)體各種組織的核細(xì)胞均有全套基因組DNA,可以作為分析的材料,而不必考慮表達(dá)問(wèn)題,是目前診斷技術(shù)中最具發(fā)展前途的技術(shù)。,基因診斷的對(duì)象,1病原生物的侵入,如肝炎、艾滋病、支原體、細(xì)菌、寄生蟲。2先天遺傳性疾患,如苯丙酮尿癥、無(wú)丙種球蛋白血癥。3后天基因突變引起的疾病,如腫瘤。4其它,如親子鑒定、個(gè)體識(shí)別、法醫(yī)物證。,基因診斷的內(nèi)容與疾病相關(guān)的遺傳物質(zhì)改變主要有兩類,1遺傳物質(zhì),即DNA或RNA的水平的變化。如病毒感染時(shí)病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在人體內(nèi)的從無(wú)到有,某些腫瘤中癌基因表達(dá)水平的從低到高。,,2遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化,即基因突變。如點(diǎn)突變引起的基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起的基因激活或滅活等等。因此,從理論上說(shuō),所有涉及基因結(jié)構(gòu)和功能變化的檢測(cè)都屬于基因診斷。,基因診斷的原理核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一?;驹硎腔パa(bǔ)的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈,即能夠進(jìn)行雜交。這種結(jié)合是特異的,即嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)的原則進(jìn)行,它不僅能在DNA和DNA之間進(jìn)行,也能在DNA和RNA之間進(jìn)行。,用一段已知基因的核酸序列作出探針,與變性后的單鏈基因組DNA接觸時(shí),如果兩者的堿基完全配對(duì),它們即互補(bǔ)地結(jié)合成雙鏈,從而表明被測(cè)基因組DNA中含有已知的基因序列。進(jìn)行基因檢測(cè)有兩個(gè)必要條件一是必需的特異的DNA探針;二是必需的基因組DNA。當(dāng)兩者都變性呈單鏈狀態(tài)時(shí),就能進(jìn)行分子雜交。,,基因探針基因探針(PROBE)就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列,它可以包括整個(gè)基因,也可以僅僅是/基因的一部分;可以是DNA本身,也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來(lái)的RNA。,DNA探針根據(jù)其來(lái)源有3種1、來(lái)自基因組中有關(guān)的基因本身,稱為基因組探針(GENOMICPROBE)2、是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了MRNA,再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到的探針,稱為CDNA探針(CDNAPROBE)。與基因組探針不同的是,CDNA探針不含有內(nèi)含子序列3、可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補(bǔ)的DNA片段,稱為寡核苷酸探針,一、探針的來(lái)源,二、探針的制備一般是通過(guò)分子克隆(MOLECULARCLONING)獲得的??寺∈侵赣脽o(wú)性繁殖方法獲得同一個(gè)體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。,當(dāng)制備基因組DNA探針進(jìn),應(yīng)先制備基因組文庫(kù),即把基因組DNA打斷,或用限制性酶作不完全水解,得到許多大小不等的隨機(jī)片段,將這些片段體外重組到運(yùn)載體(噬菌體、質(zhì)粒等)中去,再將后者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸肝菌,這時(shí)在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑,通過(guò)原位雜交,從中可篩出含有目的基因片段的克隆,然后通過(guò)細(xì)胞擴(kuò)增,制備出大量的探針。,制備CDNA探針,離純化相應(yīng)MRNA,人工合成寡核苷酸探針,已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量,三、探針的標(biāo)記,為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交,有必要對(duì)探針加以標(biāo)記,以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào),通常采用放射性同位素32P標(biāo)記探針的某種核苷酸Α磷酸基。近年來(lái)已發(fā)展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體等作為標(biāo)記物的方法。但都不及同位素敏感。,最常用的探針標(biāo)記法,缺口平移法NICKTRANSLATION,,隨機(jī)引物法即向變性的探針溶液加入6個(gè)核苷酸的隨機(jī)DNA小片段,作為引物,當(dāng)后者與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合后,按堿基互補(bǔ)原則不斷在其3’OH端添加同位素標(biāo)記的單核苷酸,這樣也可以獲得比放射性很高的DNA探針。,限制性核酸內(nèi)切酶,限制性核酸內(nèi)切酶(RESTRICTIONENDONUCLEASE),又簡(jiǎn)稱限制酶或內(nèi)切酶。它們是基因工程和基因診斷重要的一類工具酶。限制酶能特異地識(shí)別和切割特異的核苷酸序列,將雙鏈DNA切成較小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上,并被分離出來(lái)。,每種限制酶識(shí)別和切割的通常為46個(gè)核苷酸序列,稱為限制性位點(diǎn)RESTRICTIONSITES或切點(diǎn)。限制酶切割雙鏈DNA的方式有兩種,產(chǎn)生的末端也有兩種第一種是交錯(cuò)切割,即兩條鏈的切點(diǎn)不在同一水平而是相隔數(shù)個(gè)堿基,故斷口產(chǎn)生兩小段自身互補(bǔ)的單鏈,這種末端容易互補(bǔ)連接,稱為粘性末端(COHESIVETERMINUS);,限制性位點(diǎn),第二種為平整切割,即兩條鏈在同一水平切開,得到平齊末端(BLUNTTERMINUS)。,5′GAATTC3′3′CTTAAG5′,,,5′GGCC3′3′CGCG5′,由于具有相同粘性末端的DNA片段在DNA連接酶的作用下很容易共價(jià)連接,因此被廣泛地應(yīng)用于重組DNA操作中。具有相同平齊末端的DNA片段也可以連接,但連接效率只有粘性末端連接效率的1%。,常用基因診斷的技術(shù),1HYBRIDIZATION2聚合酶鏈反應(yīng)PCR3限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性RFLP4擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性AFLP5寡核苷酸探針ASO6單鏈構(gòu)象多態(tài)性SSCP,每個(gè)人的DNA是不完全相同的,一般每100-500BP就有一個(gè)是不相同的,即多態(tài)性。在兩套基因組DNA中平均有1000萬(wàn)處不同,它們多位于內(nèi)含子序列中。堿基的變異就可能導(dǎo)致酶切點(diǎn)的消失或新的切點(diǎn)出現(xiàn),當(dāng)使用同一限制酶切割不同個(gè)體基因組DNA時(shí),DNA片段長(zhǎng)度出現(xiàn)差異,這種由于內(nèi)切酶切點(diǎn)變化所導(dǎo)致的DNA片段長(zhǎng)度的差異,稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM,RFLP)。RFLP反映了常見的個(gè)體間DNA核苷酸的可遺傳性變異,它按照孟德爾方式遺傳。RFLP可用SOUTHERN印跡雜交法檢出。,1RFLPRESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM,,等位基因2由于出現(xiàn)新的切點(diǎn),DNA片段縮至8KB。,DNA片段電泳后雜交圖,,,,,,,,,RFLP的檢出等位基因1因有額外切點(diǎn)而導(dǎo)致產(chǎn)生兩個(gè)長(zhǎng)短不同的DNA片段(3KB及5KB)且均能與探針雜交。,在人類基因組中還存在一類DNA重復(fù)序列,稱為小衛(wèi)星DNA。它們分布十分廣泛,每個(gè)重復(fù)單位通常只有幾--幾十個(gè)堿基對(duì),但其重復(fù)次數(shù)在人群中是高度變異的,又叫數(shù)目變異的串聯(lián)重復(fù)(VARIABLENUMBERTANDEMREPEATS,VNTR)。當(dāng)用限制酶切割VNTR區(qū)時(shí),只要酶切點(diǎn)不在重復(fù)區(qū)內(nèi),就可能得到各種長(zhǎng)度不同的片段,可用于致病基因的連鎖分析。,串聯(lián)重復(fù)的短片段的長(zhǎng)度多態(tài)性可以通過(guò)PCR擴(kuò)增后電泳來(lái)檢出,并用于致病基因的連鎖分析,這種診斷方法稱為擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)連鎖分析法。PCR擴(kuò)增后,產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時(shí)只有幾個(gè)核苷酸,故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析。,2AFLP(AMPLIFIEDFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM),當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時(shí),可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針(ALLELESPECIFICOLIGONUCLEOTIDE,ASO)用同位素或非同位素標(biāo)記進(jìn)行診斷。探針通常為長(zhǎng)20BP左右的核苷酸。用于探測(cè)點(diǎn)突變時(shí)需要合成兩種或兩種以上的探針,一種與正?;蛐蛄型耆恢拢芘c之穩(wěn)定地雜交,但不能與突變基因序列雜交;另一種與突變基因序列一致,能與突變基因序列穩(wěn)定雜交,但不能與正?;蛐蛄蟹€(wěn)定雜交,這樣,就可以把只有一個(gè)堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來(lái)。,3ASO(ALLELESPECIFICOLIGONUCLEOTIDE),PCR可結(jié)合ASO,即PCR-ASO技術(shù),即先將含有突變點(diǎn)的基因有關(guān)片段進(jìn)行體外擴(kuò)增,然后再與ASO探針作點(diǎn)雜交,這樣大大簡(jiǎn)化了方法,節(jié)約了時(shí)間,而且只要極少量的基因組DNA就可進(jìn)行。,等位基因特異的寡核苷酸探針ASO檢測(cè)點(diǎn)突變,4、聚合酶鏈反應(yīng)(POLYMERASECHAINREACTION,PCR),PCR原理,PCR原理,,,1變性,PCR原理,,,1復(fù)性,,,PCR原理,,,1延伸,,,,,PCR原理,,,2變性,,,,,PCR原理,,,2復(fù)性,,,,,,,,,PCR原理,,,2延伸,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,3變性,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,3復(fù)性,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,3延伸,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,DNA以指數(shù)形式擴(kuò)增2N,其中長(zhǎng)片段以線性形式擴(kuò)增2N2,最終主產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在兩個(gè)引物之間。,預(yù)變性9295?C,25M,變性9295?C,30S,復(fù)性4060?C,30S,延伸72?C,3060S,總延伸72?C,7M,,,,,,2535,PCR的一般過(guò)程,經(jīng)過(guò)30次的循環(huán),擴(kuò)增的DNA片段可達(dá)100萬(wàn)倍以上。,5、SOUTHERN雜交法,細(xì)胞,基因診斷的臨床檢測(cè)應(yīng)用,1基因診斷在感染性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用乙型肝炎病毒(HBV)、人乳頭瘤病毒(HPV)其DNA可以使用點(diǎn)雜交、PCR方法直接檢出。丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)其RNA可以使用RTPCR方法直接檢出。結(jié)核桿菌和瘧原蟲的分型可以使用探針雜交和PCR方法檢出。,丙型肝炎HCV基因診斷實(shí)例,丙型肝炎為RNA病毒,9500MER,編碼30113033個(gè)氨基酸,具有高變異性。基因組組成,NCR非編碼區(qū),5′NCR為保守的區(qū)域,將引物設(shè)計(jì)在該區(qū)域,進(jìn)行RTPCR,可特異性的擴(kuò)增HCV。,PCR引物5’GATTCTCGAGGCGACACTCCACCATAGAT5’ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACCT,2基因診斷在遺傳病檢測(cè)中的應(yīng)用鐮狀細(xì)胞貧血癥(?GLOBIN,?6),其GAG?GTG的突變,可用RFLP(MSTII,CCTNAGG)或PCRSSCP檢出。,甲型血友?。‵VIII-,XR)可用PCRRFLP檢出。,,,142BP99BP,3基因診斷在腫瘤檢測(cè)中的應(yīng)用在許多腫瘤中存在的癌基因RAS、MYC等的突變抗癌基因P53、RB等的突變、丟失可用PCR、PCRASO、PCRSSCP等方法檢出。,4基因診斷在個(gè)體識(shí)別中的應(yīng)用鑒定基因多態(tài)性的方法均可用于親子鑒定、個(gè)體識(shí)別、法醫(yī)物證,基因治療(GENETHERAPY),基因治療的策略,1、生殖細(xì)胞基因治療生殖細(xì)胞基因治療GERMCELLGENETHERAPY是將正?;蜣D(zhuǎn)移到患者的生殖細(xì)胞(精細(xì)胞、卵細(xì)胞中早期胚胎)使其發(fā)育成正常個(gè)體,顯然,這是理想的方法。1、體細(xì)胞基因治療體細(xì)胞基因治療SOMATICCELLGENETHERAPY是指將正常基因轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞,使之表達(dá)基因產(chǎn)物,以達(dá)到治療目的。,基因治療的方法,1.基因轉(zhuǎn)移方法(1)特異正常基因的分離與克?。?)外源基因的轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移(GENETRANSFER)是將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)。,基因轉(zhuǎn)移方法,1)化學(xué)法將正常基因DNA(及其拷貝)與帶電荷物質(zhì)和磷酸鈣、DEAE-葡萄糖或與若干脂類混合,形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒,直接傾入培養(yǎng)基中與細(xì)胞接觸,由于鈣離子有促進(jìn)DNA透過(guò)細(xì)胞有作用,某些化合物可擾亂細(xì)胞膜,故可將DNA輸入細(xì)胞內(nèi),并整合于受體細(xì)胞的基因組中,在適當(dāng)?shù)臈l件下,整合基因得以表達(dá),細(xì)胞亦可傳代。方法簡(jiǎn)單,但效率極低,一般1000-100000個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞可結(jié)合導(dǎo)入的外源基因。,2)物理法包括電穿孔法和直接顯微注射法,①電穿孔法電穿孔法(ELECTROPOROTION)是將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中,通過(guò)電擊使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔,周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞,但有時(shí)也會(huì)使細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。②顯微注射法顯微注射(MICROINJECTION)是在顯微鏡直視下,向細(xì)胞核內(nèi)直接注射外源基因,這種方法應(yīng)是有效的。但一次只能注射一個(gè)細(xì)胞,工作耗力費(fèi)時(shí)。此法用于生殖細(xì)胞時(shí),有效率可達(dá)10%。直接用于體細(xì)胞卻很困難。,③脂質(zhì)體法脂質(zhì)體(LIPOSOME)法是應(yīng)用人工脂質(zhì)體包裝外源基因,再與靶細(xì)胞融合,或直接注入病灶組織,使之表達(dá)。,3)同源重組法同源重組(HOMOLOGOUSRECOMBINATION)是將外源基因定位導(dǎo)入受體細(xì)胞的染色體上,在該座位因有同源序列,通過(guò)單一或雙交換,新基因片段替換有缺陷的片段,達(dá)到修正缺陷基因的目的。,4)病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移前述的化學(xué)和物理方法都是通過(guò)傳染方式基因轉(zhuǎn)移。病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移(VIRALMEDIATEDGENETRANSFER)是通過(guò)轉(zhuǎn)換方式完成基因轉(zhuǎn)移,即以病毒為載體(VECTOR),將外源目的基因通過(guò)基因重組技術(shù),將其組裝于病毒上,讓這種重組病毒去感染受體宿主細(xì)胞,這種病毒稱為病毒運(yùn)載體(VIRALVECTOR)。,兩種病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法,①反轉(zhuǎn)錄病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒雖是RNA病毒,但有反轉(zhuǎn)錄酶,可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA,再整合到宿主細(xì)胞基因組。②DNA病毒介導(dǎo)載體(DNAVIRALMEKIATEDVECTOR)DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等。,1、靶細(xì)胞,靶細(xì)胞是指接受轉(zhuǎn)移基因的體細(xì)胞。選擇靶細(xì)胞的原則是①必須較堅(jiān)固,足以耐受處理,并易于由人體分離又便于輸回體內(nèi);②具有增殖優(yōu)勢(shì),生命周期長(zhǎng),能存活幾月至幾年,最后可延續(xù)至病人的整個(gè)生命期③易于受外源遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化;④在選用反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí),目的基因表達(dá)最好具有組織特異性的細(xì)胞。,基因治療存在問(wèn)題與倫理學(xué),存在著若干重要問(wèn)題1.導(dǎo)入基因的穩(wěn)定高效表達(dá)外源基因轉(zhuǎn)移入病人體內(nèi)細(xì)胞表達(dá),首先與轉(zhuǎn)移方法有關(guān)?;瘜W(xué)和物理方法所導(dǎo)入的基因效率低,自然表達(dá)也差。2.導(dǎo)入基因的安全性基因治療的安全性應(yīng)確保不因?qū)胪庠茨康幕蚨a(chǎn)生新的有害遺傳變異,這是因?yàn)椴捎梅崔D(zhuǎn)錄病毒載體而引起的問(wèn)題。,3.基因治療與社會(huì)倫理道德體細(xì)胞基因治療是符合倫理道德的,但試圖糾正生殖細(xì)胞遺傳缺陷或通過(guò)遺傳工程手段來(lái)改變正常人的遺傳特征則是引起爭(zhēng)議的領(lǐng)域。,基因治療必須具備下列條件,①選擇適當(dāng)?shù)募膊。?duì)其發(fā)病機(jī)理及相應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)功能了解清楚;②糾正該病的基因已被克隆,并了解該基因表達(dá)與調(diào)控的機(jī)制與條件;③該基因具有適宜的受體細(xì)胞并能在體外有效表達(dá);④具有安全有效的轉(zhuǎn)移載體和方法,以及可供利用的動(dòng)物模型。,
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上傳時(shí)間:2024-01-06
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