簡(jiǎn)介:第17章核酸技術(shù),(一)重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ)(二)重組DNA技術(shù)的基本操作過(guò)程(三)重組DNA技術(shù)的應(yīng)用,,(一)重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ),重組DNA技術(shù)的定義,在體外,將一種外源DNA和載體DNA重新組合連接,形成雜交DNA,然后將其轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞,最終使外源DNA在宿主細(xì)胞中隨著宿主細(xì)胞的繁殖而增殖和表達(dá),從而改變生物原有遺傳性狀的過(guò)程,稱為重組DNA技術(shù)。它是按生物科學(xué)規(guī)律,在體外人為的改造基因,最終往往使生物的遺傳性狀獲得改變,故又稱為“遺傳工程”,亦即“基因工程”。,1重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ),1重要的工具酶2載體,(1)重要的工具酶,它能夠識(shí)別、切割雙鏈DNA分子中的特定序列,這些特定序列多數(shù)為反向重復(fù)序列,一般長(zhǎng)度是4、5或6BP。,①限制性內(nèi)切酶,①粘性末端如ECORI5’GAATTCCTTAAG3’②平齊末端如HAEIII5’GGCCCCGG3’,,,,,,,,,,②DNA連接酶,目前使用的連接酶有兩種大腸桿菌DNA連接酶黏性末端連接;T4連接酶黏性和平齊末端連接。,(2)載體,概念能將外源DNA帶入宿主細(xì)胞,進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增或最終使外源基因得以表達(dá)的自主DNA,稱為載體(VECTOR)。分類①克隆載體用于基因的復(fù)制、擴(kuò)增、測(cè)序等;②表達(dá)載體用于目的基因的表達(dá)。,(二)重組DNA技術(shù)的基本操作過(guò)程,1目的基因的獲得2選擇和制備載體3將目的基因與載體進(jìn)行切割連接4將重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞5陽(yáng)性克隆的篩選和鑒定6DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)等研究,,,重組DNA技術(shù)的基本操作過(guò)程,1目的基因的獲得,(1)提取DNA后,PCR體外特異擴(kuò)增(2)以MRNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成CDNA。(3)化學(xué)合成基因(4)限制性內(nèi)切酶從載體上切取(5)構(gòu)建基因文庫(kù),調(diào)取目的基因,2載體的選擇和制備,原核生物常用的載體質(zhì)粒和噬菌體;真核生物常用的載體動(dòng)物病毒、酵母;穿梭載體通常是指那些既能在真核細(xì)胞中繁殖又能在原核細(xì)胞中繁殖的載體。,,,目的基因與載體的酶切與連接,3,4重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞,大腸桿菌、酵母、真菌及各種真核細(xì)胞、受精卵細(xì)胞都可用于重組。,轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)染,,5目的基因的篩選和鑒定,(1)遺傳學(xué)方法(2)核酸雜交法(3)PCR方法(4)酶切鑒定,,(1)遺傳學(xué)方法,利用載體的特殊標(biāo)記如質(zhì)粒含有抗青霉素的基因,當(dāng)含外源DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后可在含有青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),而未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細(xì)菌在同樣的條件下不能生長(zhǎng)。,(2)核酸雜交法,,菌落原位雜交,,,2,,,3,6,,2,,,,6,(3)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的一種DNA特定片段體外快速合成擴(kuò)增的方法,稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(POLYMERASECHAINREACTION,PCR)。PCR技術(shù)具有高度的靈敏性和特異性,能在極短的時(shí)間內(nèi)將目的基因擴(kuò)增至數(shù)百萬(wàn)倍,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳,可以直接觀察產(chǎn)物的存在。因此,PCR技術(shù)對(duì)于鑒定陽(yáng)性克隆十分有效,而且無(wú)需制備DNA。,,,(4)酶切鑒定,,,目的基因表達(dá),6,(三)重組DNA技術(shù)的應(yīng)用,1DNA指紋技術(shù)2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物克隆3基因診斷與基因治療,1DNA指紋技術(shù),DNA指紋DNAFINGERPRINT技術(shù)是20世紀(jì)70年代末發(fā)展起來(lái)的遺傳標(biāo)記的方法。遺傳標(biāo)記(GENETICMARKER)是指可用來(lái)區(qū)分不同群體或個(gè)體,又能穩(wěn)定遺傳的某些物質(zhì)。生物個(gè)體間的差異在本質(zhì)上是DNA的差異,因此DNA是最可靠的遺傳標(biāo)記。,(1)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性,真核生物的DNA分子很長(zhǎng),在遺傳過(guò)程中DNA堿基由于替換、重排、插入、缺失等原因,在子代DNA中會(huì)引起差異形成多態(tài)性。當(dāng)用一種限制性內(nèi)切酶去切DNA時(shí),DNA分子會(huì)降解成許多長(zhǎng)短不等的片段,個(gè)體間這些片段是特異的,可以作為某一DNA(生物)的標(biāo)記,將這種方法稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM,RFLP)。,,,,個(gè)體1,個(gè)體2,在人體DNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的由9–70BP重復(fù)單位串聯(lián)重復(fù)排列而成的高變異區(qū),稱為小衛(wèi)星DNA(MINISATELLITEDNA)。不同個(gè)體的多態(tài)性來(lái)源于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)不同,同一家族小衛(wèi)星重復(fù)單位含有相同或相似的核心序列,用某一小衛(wèi)星DNA作探針,可與同一或不同物種多酶切DNA片段雜交,獲得DNA指紋圖譜(DNAFINGERPRINT)。所有真核生物基因組中還存在由26BP為重復(fù)單位的重復(fù)順序,因其重復(fù)單位比小衛(wèi)星短,稱為微衛(wèi)星DNA(MICROSATELLITEDNA)。,真核生物的小衛(wèi)星DNA,人的DNA指紋圖譜,,(2)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RANDOMLYAMPLIFIEDPOLYMORPHICDNA,RAPD),又稱隨機(jī)引物PCR。是以9–10個(gè)核苷酸的隨機(jī)序列作引物,以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物電泳后紫外觀察,不同個(gè)體的圖帶差異明顯,如DNA指紋圖譜一樣。,,,,,個(gè)體1,個(gè)體2,2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物克隆,(1)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(2)體細(xì)胞克隆無(wú)性繁殖,,1982年,人們將大白鼠的生長(zhǎng)激素基因放在質(zhì)粒中小白鼠金屬巰基蛋白啟動(dòng)子之后。將重組好的這種質(zhì)粒,用特制的微量注射器注入小鼠受精卵的雄性原細(xì)胞核中,再將這個(gè)受精卵植入小鼠子宮中。,(1)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,,啟動(dòng)子,結(jié)果為發(fā)育成熟的小鼠體重比對(duì)照小鼠大兩倍,成為“碩鼠”或“超級(jí)鼠”。,1986年,美國(guó)制備出轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因的豬。這種豬生長(zhǎng)快,飼料轉(zhuǎn)換率和瘦肉率顯著提高而肥膘低,與注射生長(zhǎng)激素的效果相同。我國(guó)現(xiàn)制備出轉(zhuǎn)基因豬、羊、兔等。然而,轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因的豬生殖能力明顯下降,不能繁殖擴(kuò)群。,,2019年7月世界第一例從成年動(dòng)物體細(xì)胞,克隆出的哺乳動(dòng)物綿羊“多利”誕生。2019年2月NATURE雜志報(bào)道將這個(gè)秘密向世人公布。,(2)體細(xì)胞克隆無(wú)性繁殖,克隆羊多利的產(chǎn)生過(guò)程,,多利羊之父威爾穆特教授英國(guó)愛(ài)丁堡羅斯林研究所,蘇格蘭胚胎學(xué)家。,2019年克隆批量化,美國(guó)克隆出50多只老鼠。日本克隆出8只完全一樣的小牛。,美國(guó)俄勒岡州沃爾小組成功克隆兩只恒河猴。,2000年人類的近親被克隆,克隆豬同年,幫助培育出多利羊的生物技術(shù)公司克隆出5只小豬仔,并宣稱克隆豬終將成為人類移植器官的“加工廠”,生產(chǎn)器官包括角膜、皮膚、腎、肝、肺、心臟等。珍稀瀕危動(dòng)物的繁殖克隆大熊貓的實(shí)驗(yàn)已開(kāi)始報(bào)道。,2019年至今關(guān)于克隆人,關(guān)于克隆人的問(wèn)題爭(zhēng)論的很激烈,在理論上,利用同樣方法,人可以克隆人,但各國(guó)至今還不允許克隆人。2019年,美、意科學(xué)家聯(lián)手展開(kāi)克隆人體胚胎的工作。11月,美國(guó)科學(xué)家宣布首次克隆成功了處于早期階段的人類胚胎,稱其目標(biāo)是為病人“定制”出不會(huì)誘發(fā)排異反應(yīng)的人體細(xì)胞用于移植。,2019年8月11日英國(guó)頒發(fā)全球首張“克隆人類胚胎”執(zhí)照,合法執(zhí)照有效期為一年,胚胎14天后必須毀壞,培育克隆嬰兒仍屬非法行為。研究目的①增加人類對(duì)自身胚胎發(fā)育的理解;②增加人類對(duì)高危疾病的認(rèn)識(shí)和高危疾病治療方法的研究。,克隆動(dòng)物存在的問(wèn)題,克隆動(dòng)物健康問(wèn)題很多,世界各地的克隆動(dòng)物流產(chǎn)、夭折、畸形現(xiàn)象非常嚴(yán)重。盡管現(xiàn)在關(guān)于克隆的爭(zhēng)論很多,但有一點(diǎn)是肯定的,那就是克隆技術(shù)遠(yuǎn)不成熟,應(yīng)用克隆技術(shù)時(shí)需格外慎重。多利雖順利懷孕生子,但壽命短,2019年月2月15日,僅6歲半的多利羊死亡。,,3基因治療,是指在特定靶細(xì)胞的基因組中,插入外源基因或用外源基因置換異?;?,使細(xì)胞表達(dá)本來(lái)該基因不表達(dá)的產(chǎn)物,籍以補(bǔ)償或抑制異常表達(dá)的基因,達(dá)到治療疾病目的,稱為基因治療(GENETHERAPY)。,,,思考題,1簡(jiǎn)述DNA重組技術(shù)的基本過(guò)程2基因工程載體包括哪些種類3獲得目的基因的方法有哪些4試述核酸鑒定與DNA重組技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。,
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