簡介：中國科學技術大學博士學位論又人源CFIM復合物識別PREMRNA的分子機制及酵母PUB1蛋白結構的生物學研究作者姓名李恒學科專業(yè)生物化學和分子生物學導師姓名滕脈坤教授牛立文教授完成時間二。一O年四月二十日UNIVERSITYOFSCIENCEANDTECHNOLOGYOFCHINAADISSERTATIONFORDOCTOR’SDEGREESTRUCTURAIBASISOFPREMRNARECOGNITIONBYCFIMANDTHESTRUCTUREOFYEASTPUB1AUTHOR’SNAMEHENGLISPECIALITYBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOLOGYSUPERVISORPROFMAIKUNTENGPROFLIWENNIUFINISHEDTIMEAPRIL20加，2010

簡介：IILILLLLLLLLLLLLILIIIIILLLIIIIIIKLLIIQLLIIIY3261082單位代碼10602學號2叭501L100分類號G63391密級公開囫屋西吁謹靠謦＼／GUAN6XLNORMALU～LVERSN’V碩士專業(yè)學位論文微視頻資源在高中生物學課堂教學中的應用研究以人教版高中生物學分子與細胞模塊為例APPLICATIONRESEARCHONMICROVIDEESOURCESSTUDIESFORBIOLOGYCLASSROOMTEACHINGINSENIORHIGHSCHOOLTHKETHEMODULEPMOLECULARANDCELL”THECOMPULSORYBIOLOGYTEXTBOOKFOREXAMPLE學院專業(yè)研究方向年級研究生指導教師完成日期生命科學學院學科教學生物生物課程與教學論2015級楊艷英周善義教授2017年4月微視頻資源在高中生物學課堂教學中的應用研究以人教版高中生物學分子與細胞模塊為例研究生楊艷英年級2015級導師周善義教授學科專業(yè)學科教學生物研究方向生物課程與教學論摘要隨著信息化的不斷發(fā)展，現(xiàn)代設備彌補了傳統(tǒng)的教學工具的不足，促進了教學形式的更新，最終使得教學資源多樣化的發(fā)展。利用信息化的教學資源來激發(fā)學生的學習興趣和提高課堂教學的效率受到教育界的重視。微視頻是最近出現(xiàn)的新興概念，如何在課堂教學中充分利用微視頻資源成為未來教育研究熱門的話題。本研究以微學習理論、建構主義為理論和多元智能理論為指導，采用文獻研究法、問卷調查法和教育實驗法等研究方法，結合高中生物學教學實踐，以富川高級中學高一年級生物學教學為基礎，通過對課堂教學的實驗來探索微視頻資源在高中生物學課堂教學中的應用效果，驗證微視頻資源在提高高中生物學教學現(xiàn)狀的積極效用。本文的核心內容是研究如何應用微視頻資源來提高高中生物學課堂教學效果，具體的研究內容如下1、對微視頻資源進行概念界定，為微視頻資源提高高中生物學教學效果尋找理論依據。2、對微視頻資源的來源、微視頻的制作進行了系統(tǒng)的總結。3、對微視頻資源在高中生物學課堂教學中的具體應用模式給出建議。4、以分子與細胞一書為例，在分析教學內容的基礎上，探討了微視頻資源應用于高中生物學課堂教學的可能性及應用效果。5、教學實踐對象富川高級中學的高一年級12班和13班，12班采用微視頻資源教學，作為實驗班，13班不采用微視頻教學，作為對照班。設計了一節(jié)課的調查問卷、考試試題和一個學期的調查問卷、考試試題來驗證應用微視頻資源輔助高中生物學課堂教學對學生的影響。研究表明，微視頻資源在高中生物學課堂教學中的應用，能激發(fā)學生的學習興趣、提高學生課堂學習效率、增強學生的學習積極性；提高學生的學習成績，促進學生對生物學科知識的理解和應用。本文對微視頻在高中生物學課堂教學中應用的研究，希望能提高一線教育工作者對微視頻資源重要性的認識，增強教師獲取微視頻資源信息和利用現(xiàn)代教育設備技術的能力，對提高生物學課堂教學效果具有可參考的價值。關鍵詞微視頻；高中生物學；課堂教學；教學效果

簡介：指導教師簽名壘弘壘生能研究答辯委員會主席奎絲丞數(shù)援逝江太堂醫(yī)堂院委員1韭感主教援浙江太堂醫(yī)堂院委員2睦全震巫究雖國塞瀣注屋箍三漁注硒究逝委員3筐斂鑫熬援逝塹太堂生金型堂堂院委員4登建盛熬援逝江太堂生金型堂堂院學位論文版權使用授權書及取得的人已經發(fā)的學位或已在論文【1日本學位論文作者完全了解逝鎏盤堂有權保留并向國家有關部門或機構送交本論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權逝望盤堂可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據庫進行檢索和傳播，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。保密的學位論文在解密后適用本授權書學位論文作者簽名萎蚤嫉導師簽名簽字日期加、＼年B月【2日簽字只期叫／R年名月

簡介：分類號編號中國科學院研究生院博士學位論文云然叢僉壬絲金物塑弓I起線粒佳融金的絲堂生物堂研究樂雯指導教師隆筐巫塞雖主國科堂陵動物巫塞壓申請學位級別簋學科專業(yè)名稱細胞生物堂論文提交日期壘Q生墨月論文答辯日期星Q生墨旦答辯委員會主席樂雯天然小分子化合物S3引起線粒體融合的化學生物學研究能直接與去泛素化酶DEUBIQUITINASE相互作用。因此我們檢測了S3處理前后線粒體蛋白的泛素化水平變化，發(fā)現(xiàn)S3可以增加線粒體蛋白的泛素化水平。并且，在用S3對細胞進行處理后，MFNL和MFN2的泛素化水平都有顯著增加，但表達水平沒有明顯變化，說明這種泛素化與蛋白的降解并無關聯(lián)，而很有可能是一種新的蛋白功能調節(jié)機制。有文獻報道，USP30是一個定位于線粒體外膜的去泛素化酶。我們進一步研究表明，USP30確實參與了S3介導的線粒體融合。我們發(fā)現(xiàn)S3可以通過與USP30的活性位點結合從而抑制USP30的去泛素化酶活性。在細胞中高表達USP30，可以部分抑制S3引起的線粒體融合，而活性位點突變的USP30則沒有這種功能。在用S3處理細胞后，出現(xiàn)了很多與線粒體有共定位或依附于線粒體的泛素聚集點，這提示線粒體上蛋白的泛素化水平有所增加。應用免疫共沉淀的方法，我們發(fā)現(xiàn)USP30與MFNL及MFN2之間有相互作用。并且，在高表達USP30的情況下，MFN2的泛素化水平有明顯減少。這提示，S3可能是通過抑制USP30來調節(jié)MFNL和MFN2的泛素化水平的，而MFNL和MFN2的泛素化水平可能是MFNL和MFN2的融合活性的一個重要調控機制。但MFNL和MFN2具體是通過哪種泛素化修飾來調控線粒體融合活性的，還需要進一步的研究。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了一個新的可以促進線粒體融合的小分子化合物S3。在MFNL或MFN2敲除的細胞中，S3引起的線粒體形態(tài)變化可以恢復線粒體的正常功能。S3可以抑制線粒體定位的去泛素化酶USP30的活性，從而改變MFNL和MFN2的泛素化修飾水平，這可能是S3促進線粒體融合的機制。關鍵詞線粒體融合，小分子化合物，線粒體融合素1／2MFNL／2，去泛素化，USP30

簡介：㈣Ⅲ|||IL川IIIIIMY3298360分類號彈中唯JF鬣火垮碩士學位論文密級編號主土壘鱉堂塾堂土壘全塾壘整宣堡客以分子與細胞模塊為例學位申請人姓名塞羞疊申請學位學生類別全魚壹L塑圭申請學位學科專業(yè)鱟疊查噬生蟄2指導教師姓名蟄墊壘送⑧慧篙‰S碩士學位論文高中生物學教學中生命觀念培育研究以分子與細胞模塊為例論文作者朱為娜指導教師楊旭教授學科專業(yè)學科教學生物研究方向學科教學生物華中師范大學生命科學學院2017年5月

簡介：論文題目人教版高中生物分子與細胞生物學原理的教學探究聊城大學分類號G427單位代碼10447密級無學號1520150101專業(yè)碩士學位論文人教版高中生物分子與細胞生物學原理的教學人教版高中生物分子與細胞生物學原理的教學探究探究INVESTIGATIONTOTHETEACHINGOFBIOLOGYPRINCIPLEINTHE“MOLECULARCELLULAR”O(jiān)FHIGHSCHOOLBIOLOGY（PEPEDITION）作者姓名白璐白璐專業(yè)名稱學科教學（生物）學科教學（生物）指導教師姓名賈少波賈少波學院生命科學學院生命科學學院論文提交日期20172017年06月

簡介：點擊查看更多15467.黃渤海中華哲水蚤現(xiàn)場食物的分子生物學分析方法及應用精彩內容。

簡介：原創(chuàng)性聲明本人聲明所遞交的學位論文是本人在導師指導下進行的學術研究工作及取得的研究成果。據我所知，文中除了特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他任何人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包括未獲得注如沒有其他需要特別聲明的，本欄可空或者其他教育機構的學位或證書使用過的材料。同我一起工作的同學對本研究所做的任何貢獻均在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名垂，1繆簽字日期沙叢I年鄉(xiāng)月／婦I學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解廣西醫(yī)科大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權廣西醫(yī)科大學可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同時授權中國學術期刊光盤版電子雜志社、中國科學技術信息研究所將本學位論文收錄到中國優(yōu)秀博碩士學位論文全文數(shù)據庫、中國學位論文全文數(shù)據庫，并通過網絡向社會公眾提供信息服務。保密的學位論文在解密后適用本授權書學位論文作者簽名參L瑤導師簽字芳P／。，簽字日期加LY年占月J加簽字日期秒曠年鄉(xiāng)月／功膠愿丞凝膠透昱筮置形成的盆壬生物坐扭劍2Q12級亟堂位J盆文目錄一、摘要中文1摘要英文5二、前言10一、日U舌JU參考文獻12三、第一部分膠原水凝膠誘導大鼠骨髓問充質干細胞成軟骨形成過程中的相關信號通路151、材料152、方法163、結果284、討侖405、參考文獻44四、第二部分膠原水凝膠在體內成軟骨誘導的相關信號通路471、材料472、方法473、結果564、討侖645、參考文獻69五、附錄主要中英文縮略詞表72六、綜述731、生物材料復合干細胞成軟骨誘導作用的研究742、參考文獻82七、致謝90八、攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文91

簡介：中圖分類號UDC學校代碼10055密級公開高蕊犬淫博士學位論文球毛殼菌次生代謝的分子生物學研究MOLECULARBASISOFTHESECONDARYMETABOLISMINCHAETOMIUM答辯委員會主席陳錦英GLOBOSUM指導教師朱旭東教授南開大學研究生院二O一三年五月南開大學學位論文原創(chuàng)性聲明7㈣本人鄭重聲明所呈交的學位論文，是本人在導師指導下進行研究工作所取得的研究成果。除文中已經注明引用的內容外，本學位論文的研究成果不包含任何他人創(chuàng)作的、己公開發(fā)表或者沒有公開發(fā)表的作品的內容。對本論文所涉及的研究工作做出貢獻的其他個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本學位論文原創(chuàng)性聲明的法律責任由本人承擔。學位論文作者簽名胡田2013年5月26日非公開學位論文標注說明本頁表中填寫內容須打印根據南開大學有關規(guī)定，非公開學位論文須經指導教師同意、作者本人申請和相關部門批準方能標注。未經批準的均為公開學位論文，公開學位論文本說明為空白。論文題目申請密級口限制≤2年口秘密≤10年口機密≤20年保密期限20年月目至20年月日審批表編號批準T3期20年月日南開大學學位評定委員會辦公室蓋章有效注限制★2年可少于2年秘密★10年可少于10年機密★20年可少于20年

簡介：我們采用以PCR為基礎的分子生物學技術以及基因芯片技術建立了水中常見致病菌的檢測與鑒定系統(tǒng)第一套方法是以PCR為基礎的分子生物學檢測技術采用逐步縮小范圍的PCR技術實現(xiàn)對水中常見致病菌的檢測與鑒定第二套方法是基因芯片檢測與鑒定技術我們利用在細菌學分類上具有重要意義的16SRRNA基因作為檢測的靶分子并在期間設計檢測探針建立一套水中致病菌的基因芯片快速檢測技術4小時這兩套技術不僅具有較強的實用價值而且還可以優(yōu)勢互補第一套方法實用性強可以檢測到細菌的不同血清型但操作較復雜、耗時較長使用試劑多第二套技術檢測容量大一次實驗可以檢測幾乎所有的致病菌且操作簡例、快速使用試劑很少但需要專門的儀器設備實際應用時可依據實驗室的具體條件和需要選擇其中的任何一種

簡介：一種高效促進血小板生成的全新型融合蛋白SCFTPO的分子設計及其生物學活性研究博士后劉楠導師奚永志教授中文摘要血小板減少癥不僅是惡性血液病如白血病、淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤等誘導緩解、鞏固和加強化療階段的主要并發(fā)癥，也是實體瘤及其它影響造血細胞疾病患者放化療過程常見的嚴重并發(fā)癥。血小板減少癥的出現(xiàn)不僅增加了患者出血、感染引起的相關死亡風險，也由此限制了使用細胞毒性化療藥物的最大殺傷劑量。對肺癌、乳腺癌及卵巢癌等實體瘤有特效的新化療藥GEMCITABINE治療過程中出現(xiàn)的血小板減少癥限制了該藥物的臨床有效應用。同時，血小板減少癥也是骨髓增生異常綜合征MDS、特發(fā)性血小板減少性紫癜ITP、愛滋病AIDS及慢性肝病等疾病治療過程中常見并發(fā)癥，這類疾病出現(xiàn)的慢性血小板減少癥起因為血小板生成缺陷或減少、免疫或非免疫性血小板破壞增強，另外進行肝移植、心血管手術等患者也常伴發(fā)血小板減少癥，最終引起患者死亡率增加。有關血小板減少癥的治療始終是世界性醫(yī)學難題。目前臨床上治療嚴重血小板減少癥的唯一方法是血小板輸注。盡管輸注血小板可以暫時緩解化放療所致血小板減少引起的嚴重出血等并發(fā)癥，但多次反復輸注血小板增加了疾病傳播機會、發(fā)熱、同源免疫反應及移植物抗宿主病等不良反應，也增加了患者住院費用及輸注帶來的不適感。而且，社會上有限的供血來源也制約著血小板輸注。再者，臨床上為達到較為徹底地殺滅殘留白血病或其它腫瘤細胞而越來越多使用的多藥物、高劑量聯(lián)合化療方案和造血干細胞移植以及強支持治療也增加了對血小板成分輸血的需求。因此，為緩解血小板輸注的供需矛盾并降低血小板輸注的治療費用，以及減少血小板輸注引起的不必要的諸多不利因素，努力尋找一種有效促進血小板生成劑，從而徹底改變臨床上化放療引起的嚴重血小板減少癥，已顯得十分迫切和必要。TPO和SCF的克隆成功為解決這一醫(yī)學難題帶來了希望。細胞因子是由造血系統(tǒng)產生的一種高活性的蛋白質或多肽，通過與其細胞表面相應的受體結合，調節(jié)相應靶細胞的增殖、分化及其靶細胞介導的生物學效應過程從而參與機體造血調控、免疫應答等生理及病理過程。利用細胞因子的這一特性，憑借基因工程技術和蛋白質工程技術將兩種細胞因子構建成融合細胞因子，使之即具有單個細胞因子的生物活性，也可通過生物活性的互補及協(xié)調效應發(fā)揮出較單一細胞因子更佳的生物學活性，而同時又可避免兩種細胞因子單獨發(fā)揮作用時因高劑量使用出現(xiàn)的毒副作用，從而為細胞因子的理論研究和臨床應用提供新的方法。迄今為止，國內外學者經過不懈的努力構建了許多的細胞因子融合蛋白，比較成功細胞因子如MEN1103GMCSFEPO，PIX321GMCSFIL3和IL3EPO已進入了ⅠⅡ期臨床實驗，表現(xiàn)出較好的生物學功能和良好的臨床應用前景?？梢詳嘌?，細胞因子融合蛋白是當今免疫學研究領域的一個熱門問題。人類TPO基因定位于3號染色體長臂2區(qū)6帶或7帶3Q26，27，含5個編碼的外顯子，編碼產物為335個氨基酸，包括前面21個氨基酸的信號肽序列，分子量為70KD。TPO結構包括兩個特征性結構氨基端受體結合區(qū)和羧基端TPO糖基化區(qū)，其中154氨基酸長度的氨基端與人EPO氨基端有23％的序列同源性，與IFN較少同源，該區(qū)是TPO的功能區(qū)，主要起結合受體、信號傳導和支持細胞增殖作用；羧基端區(qū)153332約占70KDTPO的一半，與其他已知的蛋白無同源性，但富含絲，蘇和脯氨酸，主要增強TPO的穩(wěn)定性。TPO在CYS7CYS151和CYS29CYS85有兩個與其生物學功能有密切關系的二硫鍵。TPO是巨核細胞成熟的主要調節(jié)子，能誘導巨核系祖細胞的增殖；TPO也能支持造血干細胞的存活，與IL3，SCF和GMCSF協(xié)同誘導造血干細胞進入細胞循環(huán)并增加原始和分化造血祖細胞數(shù)量。干細胞因子SCF，又稱CKIT配體，是一個作用于較原始和成熟祖細胞的造血生長因子，其基因定位于12號染色體，含有8個外顯子，基因長50KB。由于外顯子6處的剪切，SCF可有兩種形式SCF248和SCF220膜結合型。SCF248在ALA165位有一個特殊的蛋白裂解位點，產生由胞外區(qū)165氨基酸組成的可溶型SCF；SCF220缺乏此裂解位點，由157氨基酸胞外區(qū)，27氨基酸跨膜區(qū)和36氨基酸胞漿區(qū)組成。兩種形式的SCF都具有生物學活性，都能促進祖細胞的存活，與其它造血細胞因子如GMCSF，EPO，GCSF和IL3協(xié)同作用支持多系克隆BFUE，CFUGM和CFUGEMM等的生長。SCF在體內外擴增干細胞、干細胞動員、再生障礙貧血等方面有廣泛的臨床應用價值。本研究通過基因工程方法設計并構建了攜帶SCFTPO融合基因的原核表達載體，收集并純化該融合蛋白。在體外實驗中證實了該融合蛋白有較好的造血促進作用。首先，根據已發(fā)表的資料設計兩對引物，以從胎肝細胞中提取總RNA為模板進行RTPCR，擴增所需的SCF和TPO氨基端功能區(qū)片段。采用融合基因策略，將SCF和TPO基因融合并連接于原核表達載體PET32A的SALINOTI位點中，通過05MIPTG誘導引發(fā)下游的SCFTPO融合基因的高表達。融合基因主要以包涵體形式表達，表達量高達全菌蛋白的30％以上。分別采用抗SCF和抗TPO的多克隆抗體對上述表達產物進行WESTERNBLOT鑒定，發(fā)現(xiàn)在60KD處分別有明顯的陽性條帶，表明我們已成功地獲得了SCFTPO融合蛋白。隨后，我們建立了高效快捷行之有效的分離大量重組SCFPO融合蛋白的下游純化路線，即金屬螯合層析法。由于所選用的原核表達載體PET32A在表達目的蛋白N端帶有6個組氨酸，這將十分有利于通過NINTA金屬螯合層析法快速高效地純化表達產物。由此方法純化的SCFPO融合蛋白的純度可達90％以上，而且總回收率高。最后我們開展了對SCFPO融合蛋白體外生物學功能的研究。采用分析軟件，對我們設計的SCFPO融合蛋白的柔性、抗原性、親水性和二級結構等分子生物學特性進行了計算機模擬預測。證明該融合蛋白保留了SCF和TPO原有氨基端的生物學特性，所設計的接頭具有高柔性、低抗原性和低表位性。選用對人GMCSF依賴的MO7E細胞株鑒定了純化復性后SCFTPO融合蛋白對MO7E細胞株的促增殖作用。MTT法檢測的結果表明SCFTPO融合蛋白能明顯刺激MO7E細胞的增殖。該融合蛋白在一定培養(yǎng)條件下對小鼠骨髓CFUMK集落細胞具有維持生長作用，這種作用可以持續(xù)3周。綜上所述，通過本研究我們成功地構建了SCFTPO融合基因的高效原核表達體系，通過純化得到了純度高達90％的目的蛋白，應用兩步透析法獲得了復性良好的SCFTPO融合蛋白，在體外實驗中初步證實SCFTPO融合蛋白同時具有SCF和TPO的生物活性，與標準品相似。SCFTPO融合蛋白能夠促進造血細胞增殖，為進一步進行，制備人SCFTPO融合蛋白以便深入研究該SCFTPO融合蛋白的體內造血活性奠定了基礎。

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簡介：在外科臨床嚴重創(chuàng)傷修復和手術治療中常需要血管移植物，自體血管取材受限，但是小于5MM直徑的人工血管或在血流速度較慢的大口徑應用的人工血管早期即易形成血栓。組織工程血管（TEBVS）是研究的方向之一，骨髓間充質干細胞（BMSCS）是重要的種子細胞來源。目前TEBVS研究的瓶頸是種子細胞在體內流體切應力作用下粘附和功能不理想，容易出現(xiàn)細胞凋亡、脫落，使移植失敗，但是目前尚沒有流體切應力對TEBVS種子細胞BMSCS活性功能影響的研究報道。因此研究流體切應力對TEBVS種子細胞BMSCS生物學功能的影響及其分子機制，對TEBVS構建具有重要的意義。目的1研究出切應力對骨髓間充質干細胞增殖、凋亡及活性的影響。2明確在流體切應力對骨髓間充質干細胞功能活性影響的關鍵蛋白質和相關基因，找到改進骨髓間充質干細胞功能的基因靶點。3研究出流體切應力對骨髓間充質干細胞功能活性影響的分子機制，為改進骨髓間充質干細胞作為TEBVS種子細胞的功能奠定基礎。方法1采用傳統(tǒng)的梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓間充質干細胞（HBMSCS），經流式細胞儀進行表面特征CD分子鑒定，并將其誘導分化為成骨細胞和脂肪細胞，并采用骨鈣素免疫組化染色和油紅O染色進行鑒定。2對第3代骨髓間充質干細胞分別給予3、10和30DYNECM2的流體切應力2H，6H，24H，通過細胞計數(shù)法測定細胞增殖曲線，應用流式細胞儀觀察增殖及凋亡，檢測CASPASE3活性和HBMSCS釋放的LDH活性。3對給予3DYNECM2切應力6H的骨髓間充質干細胞的蛋白質采用二維凝膠電泳，以靜態(tài)培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞為對照，將發(fā)生差異的蛋白質予以質譜分析，同時用免疫熒光染色和WESTERNBLOTTING的方法進一步驗證。4將3DYNECM2切應力作用6H后的HBMSCS為實驗組，以靜態(tài)培養(yǎng)的HBMSCS為對照組，通過黏附基因芯片采用OLIGOGEARRAY基因芯片實驗方法和通過凋亡基因芯片采用OLIGOGEARRAY基因芯片實驗方法進行對照研究，并應用RTPCR驗證基因芯片結果，以尋找切應力下HBMSCS變化的關鍵基因。5對HBMSCS施加不同流體切應力，觀察細胞增殖、凋亡和活性功能同時，針對切應力下HBMSCS凋亡信號傳導通路中關鍵基因應用外源性抑制劑重組基因CIAP1干預和CIAP1拮抗劑DIABLO反向干預，研究切應力下影響HBMSCS活性功能的機制。結果1所獲得的細胞符合骨髓間充質干細胞特征，HBMSCS的表面抗原分子CD29和CD105陽性，CD45、CD34和CD14均為陰性。骨鈣素免疫組化染色和油紅O染色均呈陽性，可證明能夠定向誘導分化為成骨細胞和脂肪細胞。23DYNECM2切應力下骨髓間充質干細胞2H和6H時，細胞形態(tài)未見明顯變化，G2S期的細胞百分比顯著增高，HBMSCS發(fā)生凋亡壞死顯著。而3DYNECM2切應力和10DYNECM2切應力作用24H時，可見平板流動腔內細胞數(shù)量減少，30DYNECM2切應力作用下，細胞發(fā)生顯著脫落，作用時間越長細胞脫落越顯著，HBMSCS在各組切應力作用6H時即發(fā)生顯著的凋亡、壞死。各切應力作用2H時和3DYNECM2切應力作用6H時HBMSCS中CASPASE3活性活性和LDH活性均未發(fā)生顯著變化；在10DYNECM2切應力及30DYNECM2切應力作用6H時，HBMSCS的CASPASE3活性和LDH活性顯著增加。3蛋白組學研究成功鑒定出切應力作用于HBMSCS后差異蛋白質點32個，其中蛋白質表達顯著上調有10種，蛋白質表達顯著下調有3種。其中經免疫熒光染色和WESTERNBLOTTING顯示GAPDH和ANNEXINA2表達確實顯著上調。4通過對3DYNECM2切應力作用6H后的HBMSCS基因芯片研究結果顯示，有6種在切應力作用下顯著變化的黏附基因，其中4種基因表達上調超過2倍，分別為ECM1、ICAM1、CSPG7、TIMP2；2種基因表達下調超過2倍，分別為LAMA4和VCAM1。同時有5種在切應力作用下顯著變化的凋亡基因，其中有2種表達顯著上調超過2倍的凋亡基因分別為APAF1和BOK。對基因芯片發(fā)現(xiàn)的6種顯著變化的粘附基因和5種顯著變化的凋亡基因進行了RTPCR檢測，顯示基因ECM1、ICAM1、CSPG7、TIMP2顯著增高（P＜0001和P＜001），而基因LAMA4和VCAM1顯著降低（P＜0001），基因APAF1和BOK顯著增高（P＜0001和P＜001），從而驗證了基因芯片的準確性。3DYNECM2切應力作用2H后，HBMSCSCIAP1水平升高（P＜005），但30DYNECM2切應力作用后HBMSCSCIAP1水平均降低（P＜005）。5應用CASPASE抑制劑外源性重組CIAP1干預CASPASE3的活性和LDH活性均降低，HBMSCS的凋亡減少，細胞增殖增加。加入CIAP1抑制劑DIABLO反向干預后，CASPASE3活性和LDH活性增強，細胞凋亡顯著增加。結論1首先研究發(fā)現(xiàn)低切應力（3DYNECM2）作用較短時間（≤6H）時可促進HBMSCS增殖，HBMSCS未發(fā)生顯著凋亡，同時內源性CIAP1上調；但在3DYNECM2作用12H和10DYNECM2以及30DYNECM2流體切應力下6H時HBMSCS增殖受到抑制，細胞發(fā)生顯著凋亡壞死，活性功能明顯減低。切應力越大細胞凋亡壞死越顯著。為HBMSCS種子細胞在體外應用切應力預適應、改善種子細胞的活性功能打下實驗基礎。2蛋白質組學研究和基因芯片的篩選，首先發(fā)現(xiàn)3DYNECM2的切應力作用6H后HBMSCS細胞ANNEXINA2和GAPDH表達顯著上調，有6種粘附相關基因及5種凋亡相關基因發(fā)生顯著變化，其中凋亡相關基因APAF1和BOK在切應力作用下顯著增強，顯示HBMSCS在切應力作用下凋亡與APAF1、BOK和CASPASE凋亡基因的啟動相關。為進一步改進種子細胞功能提供了基因靶點。3應用CASPASE9抑制劑干預可降低CASPASE3的活性和LDH活性，減少HBMSCS的凋亡，細胞增殖增加；加入CIAP1拮抗劑反向干預后CASPASE3活性和LDH活性增強，細胞凋亡顯著增加。從而首先實驗證實HBMSCS在切應力作用下是通過激活了凋亡信號通路機制導致細胞凋亡，出現(xiàn)HBMSCS活性功能下降。4首先應用外源性重組CIAP1干預可以實現(xiàn)抑制CASPASE3的活性和LDH活性，減少HBMSCS在切應力作用下的凋亡，使細胞增殖和活性增加。提示在基因水平對HBMSCS凋亡信號通路靶點（CASPASE）進行干預，可作為延遲種子細胞HBMSCS凋亡和改進種子細胞功能的一種手段，為TEBVS的研究提供一個有重要意義的新思路。

簡介：癌癥的致命性不僅歸咎于原發(fā)性腫瘤，而更因為轉移的發(fā)生。目前針對晚期患者的治療并不十分有效，至多能略微延長存活期。為了顯著降低癌癥的死亡率，有必要研發(fā)新的、同時針對原發(fā)和轉移腫瘤抗癌療法。旨在建立這樣一種抗癌機制，本項目推薦將OLA1OBGLIKEATPASE，一個我們近年來發(fā)現(xiàn)并致力研究的細胞應激蛋白，作為新的藥物靶點。OLA1是普遍表達于細胞漿中的屬于OBG家族的ATP水解酶ATPASE。OBG族類的ATPASE在進化中高度保守，見于從細菌到人的所有生物中，它們的具體生物學功用卻鮮為人知。在現(xiàn)有的文獻資料中除了本研究小組發(fā)表的論文外，只有個別的針對人類OLA1的研究。我們于2009年首先闡明OLA1是一個與氧化應激反應有關的內源性負性調控因子。用RNA干擾技術降低OLA1的表達KNOCKDOWN，細胞的氧化應激反應會由于一些轉錄后的機理被加強。隨后我們又發(fā)現(xiàn)，如果腫瘤細胞的OLA1被KNOCKDOWN，它們的體外遷移和侵入性能即會被顯著削弱。由此我們設想，是否可以應用下調OLA1所產生的有利效應，研討針對OLA1設計抗腫瘤轉移治療的可行性。因為基因剔除KNOCKOUT小鼠是現(xiàn)今研究基因體內功能最為可靠的動物模型。并且在藥物靶鑒定TARGETVALIDATION的領域中，分析KNOCKOUT小鼠的表型是為模擬該藥物靶被完全抑制后全身反應包括正性的期望療效和負性的毒性作用的首選程序，我們在本項目中引進了KNOCKOUT小鼠模型，并對其開展了表型研究。這是本項目的設計思路之一。本項目的另外一個重要目的是要進一步闡明OLA1作用的分子生物學機理。雖然我們的前期研究指向OLA1對細胞氧化還原平衡REDOXEQUILIBRIUM的影響，但是沒有找到它作用的代謝通道PATHWAY。我們意外地發(fā)現(xiàn)，OLA1可能是一種特殊的蛋白質翻譯后修飾機制PTM的調節(jié)因子，它負性地調節(jié)蛋白質S谷胱甘肽修飾SGLUTATHIONYLATION。SGLUTATHIONYLATION是蛋白質中半胱氨酸上的巰基SH與胞漿中氧化型谷胱甘肽GSH通過巰基硫醚交換形成的混合型二硫鍵PSSG，可逆性地發(fā)生于高氧脅迫OXIDATIVESTRESS狀態(tài)并存在于非脅迫的基線狀態(tài)。SGLUTATHIONYLATION與另一種著名的PMT，蛋白質磷酸化PROTEINPHOSPHYLATION在原理上很相象，有人推斷，SGLUTATHIONYLATION是與蛋白質磷酸化平行，并交互影響的一種重要的蛋白質活性調控和信號傳導機制。但是由于缺乏對該通道上游調控因子的定位分析，該領域只限制于小規(guī)模的研究，未得到應有的重視。我們認為，如果OLA1對SGLUTATHIONYLATION的調節(jié)功能能被肯定，其結果將不僅有助于演繹OLA1的應用價值，比如作為抗腫瘤的藥物靶，而且將促進有關PTM基本生物學現(xiàn)象的基礎研究。因此，沿著這一研究方向，進行了細致的分子生物學論證。本研究主要內容包括⑴體內OLA1KNOCKOUT研究為了深入闡明OLA1的體內生物學功能，我們建立了一株KNOCKOUT小鼠，其中的OLA1基因因被逆病毒載體的插入而滅活。發(fā)現(xiàn)～85％的純合子小鼠在圍產期階段死亡。但是幸存的小鼠可以到成年，沒有表現(xiàn)顯著的健康問題，但是個體比野生型和雜合型小鼠持續(xù)小2030％。胚胎研究發(fā)現(xiàn)，這一生長遲緩現(xiàn)象最早發(fā)生于胚胎發(fā)育的第105天，圍產期死亡的原因是肺部發(fā)育不全。我們采取了小鼠胚胎纖維母細胞MEF進行體外原代培養(yǎng)，也發(fā)現(xiàn)MEF有生長減緩和細胞周期阻滯。這些結果表明OLA1是維持體內細胞產前產后正常生長的重要基因。但是OLA1的整體缺失，并不造成發(fā)育缺陷和幸存成年鼠的健康問題。⑵OLA1作為抗腫瘤藥物靶的體外研究我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，OLA1的KNOCKDOWN會造成體外培養(yǎng)的人乳癌細胞MDAMB231的遷移和侵入滯緩。在本研究中，我們進一步發(fā)現(xiàn)，OLA1KNOCKDOWN導致乳癌細胞對ANOIKIS貼附失缺性調亡的敏感性顯著增高。最后，應用穩(wěn)定性RNA干擾技術，我們證實OLA1KNOCKDOWN會造成MDAMB231穩(wěn)定細胞株的生長速度減緩，與上述體內的KNOCKOUT結果對應一致。綜合我們既往的和現(xiàn)在的發(fā)現(xiàn)，對OLA1的靶向滅活至少會獲得如下4項對抑制腫瘤惡性表型有利的效果1↓腫瘤細胞生長，2↓遷移，3↓侵入，以及4↑ANOIKIS。因此我們推薦OLA1可作為抗腫瘤或抗腫瘤轉移的藥物靶，進入下一階段的體內TARGETVALIDATION的研究。⑶OLA1作為SGLUTATHIONYLATION調節(jié)因子的分子機理研究應用針對PSSG的特殊WESTERNBLOT和SLOTBLOT技術，發(fā)現(xiàn)，在OLA1KNOCKDOWN的多種體外培養(yǎng)人類細胞中，細胞骨架蛋白ACTIN和諸多其他蛋白具有顯著增高的基線水平PSSG。OLA1水平與整體GLOBEPSSG的負相關性也顯現(xiàn)于經受氧化劑刺激雙氧水和巰基氧化劑DIAE的細胞中。這一規(guī)律也在原代培養(yǎng)的剛從體內制備的OLA1MEF中被證實。我們推斷，OLA1對SGLUTATHIONYLATION調節(jié)功能是通過其調控直接參與SGLUTATHIONYLATION加成的酶類比如GSTΠ谷胱甘肽S轉移酶的穩(wěn)定性。OLA1與GSTΠ的結合反應也已被初步證實。根據這些結果，我們提出OLA1其實是先前尚未發(fā)現(xiàn)的SGLUTATHIONYLATION上游調控因子之一。本研究的結論與創(chuàng)新①本研究發(fā)現(xiàn)OLA1，一個首先由我們發(fā)現(xiàn)的新的氧化應激反應因子，是哺乳動物體內一個重要的與維持生長有關的基因。②OLA1參與調節(jié)重要的基本生物學過程，包括SGLUTATHIONYLATION，一個重要的蛋白質翻譯后修飾和信號傳導通道。這些發(fā)現(xiàn)有助于今后建立靶向OLA1的獨特的抗腫瘤抗轉移新藥，并增進人們對一些基本生物學現(xiàn)象，比如PTM的知識。③OLA1是一個有繼續(xù)研發(fā)價值的抗腫瘤或抗腫瘤轉移的藥物靶。