一種高效促進血小板生成的全新型融合蛋白SCF-TPO的分子設計及其生物學活性研究.pdf

1、一種高效促進血小板生成的全新型融合蛋白SCF-TPO的分子設計及其生物學活性研究博士后劉楠導師奚永志教授中文摘要血小板減少癥不僅是惡性血液病(如白血病、淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤等)誘導緩解、鞏固和加強化療階段的主要并發(fā)癥，也是實體瘤及其它影響造血細胞疾病患者放化療過程常見的嚴重并發(fā)癥。血小板減少癥的出現不僅增加了患者出血、感染引起的相關死亡風險，也由此限制了使用細胞毒性化療藥物的最大殺傷劑量。對肺癌、乳腺癌及卵巢癌等實體瘤有特效的新化療藥g

2、emcitabine治療過程中出現的血小板減少癥限制了該藥物的臨床有效應用。同時，血小板減少癥也是骨髓增生異常綜合征(MDS)、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、愛滋病(AIDS)及慢性肝病等疾病治療過程中常見并發(fā)癥，這類疾病出現的慢性血小板減少癥起因為血小板生成缺陷或減少、免疫或非免疫性血小板破壞增強，另外進行肝移植、心血管手術等患者也常伴發(fā)血小板減少癥，最終引起患者死亡率增加。有關血小板減少癥的治療始終是世界性醫(yī)學難題。 目

3、前臨床上治療嚴重血小板減少癥的唯一方法是血小板輸注。盡管輸注血小板可以暫時緩解化放療所致血小板減少引起的嚴重出血等并發(fā)癥，但多次反復輸注血小板增加了疾病傳播機會、發(fā)熱、同源免疫反應及移植物抗宿主病等不良反應，也增加了患者住院費用及輸注帶來的不適感。而且，社會上有限的供血來源也制約著血小板輸注。再者，臨床上為達到較為徹底地殺滅殘留白血病或其它腫瘤細胞而越來越多使用的多藥物、高劑量聯合化療方案和造血干細胞移植以及強支持治療也增加了對血小板成

4、分輸血的需求。因此，為緩解血小板輸注的供需矛盾并降低血小板輸注的治療費用，以及減少血小板輸注引起的不必要的諸多不利因素，努力尋找一種有效促進血小板生成劑，從而徹底改變臨床上化放療引起的嚴重血小板減少癥，已顯得十分迫切和必要。TPO和SCF的克隆成功為解決這一醫(yī)學難題帶來了希望。 細胞因子是由造血系統(tǒng)產生的一種高活性的蛋白質或多肽，通過與其細胞表面相應的受體結合，調節(jié)相應靶細胞的增殖、分化及其靶細胞介導的生物學效應過程從而參與機體

5、造血調控、免疫應答等生理及病理過程。利用細胞因子的這一特性，憑借基因工程技術和蛋白質工程技術將兩種細胞因子構建成融合細胞因子，使之即具有單個細胞因子的生物活性，也可通過生物活性的互補及協(xié)調效應發(fā)揮出較單一細胞因子更佳的生物學活性，而同時又可避免兩種細胞因子單獨發(fā)揮作用時因高劑量使用出現的毒副作用，從而為細胞因子的理論研究和臨床應用提供新的方法。迄今為止，國內外學者經過不懈的努力構建了許多的細胞因子融合蛋白，比較成功細胞因子如MEN110

6、3(GM-CSF/EPO)，PIX321(GM-CSF/IL-3)和IL-3/EPO已進入了Ⅰ/Ⅱ期臨床實驗，表現出較好的生物學功能和良好的臨床應用前景?？梢詳嘌?，細胞因子融合蛋白是當今免疫學研究領域的一個熱門問題。 人類TPO基因定位于3號染色體長臂2區(qū)6帶或7帶(3q26，27)，含5個編碼的外顯子，編碼產物為335個氨基酸，包括前面21個氨基酸的信號肽序列，分子量為70KD。TPO結構包括兩個特征性結構：氨基端受體結合區(qū)和

7、羧基端TPO糖基化區(qū)，其中154氨基酸長度的氨基端與人EPO氨基端有23％的序列同源性，與IFN較少同源，該區(qū)是TPO的功能區(qū)，主要起結合受體、信號傳導和支持細胞增殖作用；羧基端區(qū)(153-332)約占70KDTPO的一半，與其他已知的蛋白無同源性，但富含絲，蘇和脯氨酸，主要增強TPO的穩(wěn)定性。TPO在Cys7-Cys151和Cys29-Cys85有兩個與其生物學功能有密切關系的二硫鍵。TPO是巨核細胞成熟的主要調節(jié)子，能誘導巨核系祖細

8、胞的增殖；TPO也能支持造血干細胞的存活，與IL-3，SCF和GM-CSF協(xié)同誘導造血干細胞進入細胞循環(huán)并增加原始和分化造血祖細胞數量。干細胞因子(SCF)，又稱c-kit配體，是一個作用于較原始和成熟祖細胞的造血生長因子，其基因定位于12號染色體，含有8個外顯子，基因長50kb。由于外顯子6處的剪切，SCF可有兩種形式：SCF248和SCF220(膜結合型)。SCF248在Ala165位有一個特殊的蛋白裂解位點，產生由胞外區(qū)165氨基

9、酸組成的可溶型SCF；SCF220缺乏此裂解位點，由157氨基酸胞外區(qū)，27氨基酸跨膜區(qū)和36氨基酸胞漿區(qū)組成。兩種形式的SCF都具有生物學活性，都能促進祖細胞的存活，與其它造血細胞因子如GM-CSF，EPO，G-CSF和IL-3協(xié)同作用支持多系克隆BFU-E，CFU-GM和CFU-GEMM等的生長。SCF在體內外擴增干細胞、干細胞動員、再生障礙貧血等方面有廣泛的臨床應用價值。 本研究通過基因工程方法設計并構建了攜帶SCF/TP

10、O融合基因的原核表達載體，收集并純化該融合蛋白。在體外實驗中證實了該融合蛋白有較好的造血促進作用。 首先，根據已發(fā)表的資料設計兩對引物，以從胎肝細胞中提取總RNA為模板進行RT-PCR，擴增所需的SCF和TPO氨基端功能區(qū)片段。采用融合基因策略，將SCF和TPO基因融合并連接于原核表達載體PET32a的salI-NotI位點中，通過0.5MIPTG誘導引發(fā)下游的SCF-TPO融合基因的高表達。融合基因主要以包涵體形式表達，表達量

11、高達全菌蛋白的30％以上。分別采用抗SCF和抗TPO的多克隆抗體對上述表達產物進行Westernblot鑒定，發(fā)現在60KD處分別有明顯的陽性條帶，表明我們已成功地獲得了SCF-TPO融合蛋白。 隨后，我們建立了高效快捷行之有效的分離大量重組SCF-PO融合蛋白的下游純化路線，即金屬螯合層析法。由于所選用的原核表達載體pET32a在表達目的蛋白N端帶有6個組氨酸，這將十分有利于通過Ni-NTA金屬螯合層析法快速高效地純化表達產物

12、。由此方法純化的SCF-PO融合蛋白的純度可達90％以上，而且總回收率高。 最后我們開展了對SCF-PO融合蛋白體外生物學功能的研究。采用分析軟件，對我們設計的SCF-PO融合蛋白的柔性、抗原性、親水性和二級結構等分子生物學特性進行了計算機模擬預測。證明該融合蛋白保留了SCF和TPO原有氨基端的生物學特性，所設計的接頭具有高柔性、低抗原性和低表位性。選用對人GM-CSF依賴的MO-7e細胞株鑒定了純化復性后SCF-TPO融合蛋白

13、對MO-7e細胞株的促增殖作用。MTT法檢測的結果表明SCF-TPO融合蛋白能明顯刺激MO-7e細胞的增殖。該融合蛋白在一定培養(yǎng)條件下對小鼠骨髓CFU-MK集落細胞具有維持生長作用，這種作用可以持續(xù)3周。 綜上所述，通過本研究我們成功地構建了SCF-TPO融合基因的高效原核表達體系，通過純化得到了純度高達90％的目的蛋白，應用兩步透析法獲得了復性良好的SCF-TPO融合蛋白，在體外實驗中初步證實SCF-TPO融合蛋白同時具有SC