4℃冷藏血小板生物學(xué)性質(zhì)的實驗研究.pdf

1、研究目的:本研究通過體外質(zhì)量評價指標(biāo)、THP-1細(xì)胞吞噬試驗和動物體內(nèi)實驗比較4℃冷藏血小板與22℃室溫保存血小板的生物學(xué)性質(zhì)的差異,并對血小板回輸體內(nèi)后被吞噬清除的分子機(jī)制進(jìn)行了探討。同時還研究了幾種低溫保護(hù)劑對冷藏血小板的影響。
　　 材料與方法:(1)取單采血小板樣品,均分為兩份,分別在4℃和22℃條件下保存。在0d和5d時檢測體外質(zhì)量評價指標(biāo)血小板計數(shù)、平均血小板體積、PH值、血小板聚集率、低滲休克率等,觀察兩種保存條件

2、下的變化差異。(2)在1d、3d、5d、7d、10d檢測GPIbα平均熒光強(qiáng)度(MFI)和P-選擇素表達(dá)百分率(％),觀察變化趨勢和差異。(3)取單采血小板樣品,均分為兩份,分別在4℃和22℃條件下保存,第3d或5d時檢測THP-1細(xì)胞對其的吞噬率以及表面糖蛋白分子GPIbα、P-選擇素的表達(dá),觀察吞噬率與分子表達(dá)的相關(guān)性。(4)在(3)的吞噬體系中加入200mM的N-乙酰葡萄糖胺,觀察吞噬率的變化。(5)用地塞米松多次注射昆明鼠建立免

3、疫抑制動物模型,用碳粒廓清試驗評價模型的可利用性。并建立鼠血中人血小板的流式細(xì)胞儀檢測方法。(6)給地塞米松免疫抑制小鼠輸注新鮮和4℃、22℃分別保存2d的血小板,在輸注后15min,2h,4h,8h眼眶取血,以15min時鼠血中檢出的人血小板為100％,計算各時間點人血小板的回收率。(7)取1d的血小板以6596的比例加入添加液(PAS-R2),并在其中分別添加海藻糖、DMSO和葡萄糖,4℃冷藏保存2d時,取樣做THP-1細(xì)胞吞噬試驗

4、和小鼠輸注實驗,檢測吞噬率和血小板回收率:冷藏7d時,檢測體外質(zhì)量指標(biāo),觀察保護(hù)劑對血小板的冷藏保護(hù)的作用。
　　 結(jié)果:在血漿中保存5d后,4℃保存的血小板計數(shù)、pH值與室溫保存血小板無顯著差異(P＞0.05)。平均血小板體積顯著高于室溫保存的血小板(P＜0.05);低滲休克率顯著低于室溫組(P＜0.05);ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率顯著高于室溫組(P＜0.05)。觀察在血漿中保存1d-10d的血小板,室溫保存的血小板GPIbα

5、的平均熒光強(qiáng)度(MFI)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,而冷藏血小板的表達(dá)未見顯著變化;兩種溫度條件下保存的血小板隨時間延長P-選擇素表達(dá)均呈逐漸增加趨勢,且保存期末室溫組表達(dá)顯著高于冷藏組(P＜0.05);血漿中冷藏保存5天的血小板,THP-1細(xì)胞對室溫組和冷藏組的吞噬率均隨GPIbα熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)而降低(R=0.7,0.68);在吞噬體系中加入200mM的N-乙酰葡萄糖胺,室溫組和冷藏組吞噬率均顯著降低(P＜0.05)。地塞米松免疫抑制小鼠碳粒

6、廓清試驗表明,地塞米松小鼠的廓清指數(shù)(K)和吞噬指數(shù)(a)均顯著低于對照組(P＜0.05):給地塞米松小鼠輸注新鮮的和分別在4℃和22℃保存2d的血小板,結(jié)果表明,22℃保存血小板的與新鮮血小板在輸注后2h、4h和8h的血小板回收率有顯著差異(P＜0.05),與4℃保存的血小板未見顯著差異(P＞0.05)。在血小板冷藏添加液PAS-R2中添加海藻糖、DMSO和葡萄糖冷藏保存血小板2d,THP-1細(xì)胞吞噬試驗表明,添加葡萄糖對吞噬率無顯著

7、影響;添加DMSO吞噬率有所下降,但無顯著差異(P＞0.05);而添加海藻糖則能顯著降低血小板吞噬率(P＜0.05)。小鼠輸注實驗的8h回收率顯示,添加DMSO與對照組有顯著差異(P＜0.05),而葡萄糖和海藻糖則無顯著差異;保存7d時檢測血小板的體外質(zhì)量指標(biāo)發(fā)現(xiàn),添加葡萄糖組的HSR,GPIbα表達(dá)的MFI顯著低于對照組(P＜0.05),葡萄糖消耗和乳酸生成顯著高于對照組(P＜0.05);添加DMSO組的PH,GPIbα的MFI顯著均

8、高于對照組(P＜0.05),而添加海藻糖組的體外指標(biāo)與對照組無顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:冷藏對血小板造成的損傷與22℃室溫保存不同,主要表現(xiàn)在:1)血小板形態(tài)發(fā)生不可逆的改變,血小板平均體積顯著增大:2)低滲休克率顯著下降,血小板膜的完整性受到破壞;3)血小板聚集率顯著高于22℃保存血小板4)相對于冷藏血小板,室溫保存血小板的識別清除主要依賴于GPIbα的表達(dá),而冷藏血小板可能還存在其他途徑;N-乙酰葡萄糖胺可特異