口腔生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程

1、第七章 口腔生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程,提要：口腔生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程是針對(duì)口腔生物學(xué)理論課設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)內(nèi)容。其教學(xué)目的是讓學(xué)生通過(guò)實(shí)驗(yàn)，掌握基本的口腔生物學(xué)研究技術(shù)和方法，加深對(duì)理論課所學(xué)知識(shí)的理解，培養(yǎng)學(xué)生對(duì)口腔醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究的興趣，了解基本的科研設(shè)計(jì)思路，啟發(fā)學(xué)生的科研思維。,內(nèi)容目錄,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一 菌斑的采集、染色和觀察、分類(lèi) 實(shí)驗(yàn)二 變異鏈球菌的分

2、離和鑒定 實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌代謝酸的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌細(xì)胞外葡聚糖的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)五 菌斑中pH值的測(cè)定 第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)六 齦溝液中堿性磷酸酶活性的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)七 唾液鈣和磷含量的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)八 唾液分泌情況的測(cè)定,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué) 實(shí)驗(yàn)九 以釉原蛋白基因進(jìn)行性別鑒定第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)十

3、 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)十一 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)十二 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 實(shí)驗(yàn)十三 腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞劃痕法）,內(nèi)容目錄,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)一 菌斑的采集、染色和觀察、分類(lèi),實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求: 掌握牙菌斑標(biāo)本的采集、處理和常用染色——?jiǎng)偣t（congo red）負(fù)性染色的主要程序和方法，熟悉齦上或齦下菌斑中常見(jiàn)細(xì)菌的形態(tài)及分類(lèi)方法。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:

4、 菌斑標(biāo)本的采集；細(xì)菌涂片的制備、染色；染色細(xì)菌的觀察及 Listgarten分類(lèi)。實(shí)驗(yàn)設(shè)備和器材等用品： 香柏油，二甲苯，菌斑染色劑，酒精，濃鹽酸和滅菌的液狀石蠟等。無(wú)菌牙科鑷子、挖匙或探針（齦上菌斑檢查用），載玻片，滅菌取菌環(huán)可卸式取菌器或消毒濾紙（齦下菌斑采集用），含預(yù)還原轉(zhuǎn)送培養(yǎng)基的帶蓋小瓶，普通光學(xué)顯微鏡，試鏡紙，細(xì)菌接種環(huán)及裝有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿等。,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方法：,菌斑采集和處理,染

5、色,觀察,分類(lèi),第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),①齦溝內(nèi)采集法 ②牙周袋內(nèi)采集法,齦溝或牙周袋的齦下菌斑采集法,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),剛果紅負(fù)性染色方法：,Listgarten的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)：,球菌：菌細(xì)胞直徑0.5μm～1.0μm，包括少量球桿菌；直桿菌：菌細(xì)胞寬0.5μm～1.5μm，長(zhǎng)1.0μm～1.9μm，包括部分分支桿菌；絲狀菌：菌細(xì)胞寬0.5μm～1.5μm，長(zhǎng)與寬之比大于6∶1，菌細(xì)胞多為不

6、規(guī)則的長(zhǎng)絲狀桿菌；梭狀菌：菌細(xì)胞直徑0.3μm～1.0μm，長(zhǎng)約10μm，其末端呈梭狀；彎曲桿菌：菌細(xì)胞呈新月形或彎曲狀；螺旋體：菌細(xì)胞寬0.2μm～0.5μm，長(zhǎng)約10μm～20μm，螺旋形，包括大、中、小三種螺旋體。,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析：,注意事項(xiàng)： 1.染色操作中，用濃鹽酸熏蒸涂片時(shí)要小心。 2.該法不能檢測(cè)細(xì)菌的活動(dòng)性，但染色涂片可長(zhǎng)期保存。思考題：

7、 剛果紅負(fù)性染色有何優(yōu)點(diǎn)？菌斑采集時(shí)應(yīng)該注意什么？,齦上菌斑涂片剛果紅負(fù)性染色結(jié)果,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)二 變異鏈球菌的分離和鑒定,實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅?通過(guò)對(duì)菌落特點(diǎn)和菌細(xì)胞形態(tài)及革蘭染色特征的觀察，初步掌握菌斑標(biāo)本中變異鏈球菌的分離、培養(yǎng)和表型鑒定的主要程序和方法，熟悉牙菌斑中常見(jiàn)細(xì)菌的菌落特點(diǎn)、菌細(xì)胞形態(tài)及革蘭染色特點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)原理： 變異鏈球菌能發(fā)酵蔗糖等多種碳水化合物，而其他口腔鏈球菌不發(fā)酵

8、山梨醇和甘露醇；根據(jù)其菌落形態(tài)、染色特點(diǎn)及耐氧情況，以其特殊的生化反應(yīng)可以分離和鑒定變異鏈球菌。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備和器材、試劑等：厭氧培養(yǎng)裝置如簡(jiǎn)易厭氧袋、厭氧罐、厭氧培養(yǎng)箱或厭氧手套箱均可；普通孵箱，旋渦混合器，微量振蕩器，和普通光學(xué)顯微鏡?？烧{(diào)式移液器、加樣頭，小試管，三角形推棒，接種環(huán)、酒精燈，載玻片，無(wú)菌棉簽，96孔反應(yīng)板，EP管；口腔檢查用口鏡，鑷子，檢查盤(pán)，無(wú)菌紗球，無(wú)菌探針和齦上鋤形

9、潔治器。革蘭染色試劑，系列生化基質(zhì)和指示劑（包括甘露醇、山梨醇、菊糖、精氨酸試劑、七葉苷水解試劑）。變異鏈球菌ATCC25175懸液。MS瓊脂、BHI瓊脂培養(yǎng)基、巰基乙醇酸鹽轉(zhuǎn)送液，0.2mol/L、pH 7.0～ 的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)等。,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方法：變異鏈球菌群細(xì)菌的分離和表型鑒定,菌斑標(biāo)本,接種到MS或TS瓊脂上,微氧孵育（37℃、5%～10% CO2 48小時(shí)）或厭氧孵育（37℃48

10、小時(shí)、90%N2+ 10%CO2或 80%N2+10%CO2+10%H2）,菌落、菌細(xì)胞形態(tài)檢查,生化鑒定,確定菌種,,,,,,,次代培養(yǎng)純化、富集,分散、稀釋,置轉(zhuǎn)送液中運(yùn)送,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),革蘭染色步驟：,細(xì)菌涂片加熱固定,加革蘭（堿性結(jié)晶紫）甲液、乙液各一滴，混勻后初染30秒,革蘭碘液媒染30秒,丙酮-乙醇混合脫色劑脫色5～10秒,石炭酸復(fù)紅復(fù)染5秒,干燥后1000倍顯微鏡油鏡下觀察,水洗,,,,,,水洗,水洗,水洗,

11、第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),表型鑒定——（1）菌落特征觀察,初代培養(yǎng)的菌落觀察要點(diǎn)： 形態(tài)：如水滴狀、圓形、絲狀、不規(guī)則狀、根狀、梭形等。 大?。壕渲睆揭话阋詍m計(jì)，注意大小的一致性。 厚?。罕馄?、丘狀、凸、半球狀、瘤狀(中央凸)。 顏色：無(wú)色、白、黃、紅、綠、黑或棕色。 邊緣：如整齊、鋸齒狀、波狀等。 透明度：透明、半透明、不透明。 菌落型：光滑、粗糙、黏液樣。 溶血型

12、：α、β、γ（限血平板）。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)果評(píng)價(jià),在5%～10%CO2、90%～95%的N2，或80% N2、10%CO2和10%H2的大氣環(huán)境下37℃孵育48小時(shí),第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),表型鑒定——（2）菌細(xì)胞形態(tài)和染色特征觀察,菌細(xì)胞形態(tài)：球形、桿形、球桿形、彎曲狀、梭狀、菌細(xì)胞末端形狀、細(xì)胞內(nèi)有無(wú)顆粒、腫脹等。革蘭染色特征：陽(yáng)性、陰性染色,染色均勻性。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)果評(píng)價(jià),第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),生化鑒定：,革蘭染色鑒定

13、次代培養(yǎng)為純培養(yǎng)后，收集瓊脂表面的菌苔，用PBS稀釋成2×109/ml菌量,取待測(cè)的細(xì)菌懸液100μl，加入10個(gè)反應(yīng)板微孔中,分別加入100 μl不同的生化基質(zhì)，各加2孔,同時(shí)加PBS為陰性對(duì)照，加變異鏈球菌ATCC25175為陽(yáng)性對(duì)照,振搖混合30秒后，37 ℃孵育4小時(shí)-24小時(shí),取出反應(yīng)板，加入指示劑，觀察記錄結(jié)果,,,,,,實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)果評(píng)價(jià),第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),生化鑒定——反應(yīng)板微量快速生化實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)、試劑及

14、結(jié)果：,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),反應(yīng)板微量快速生化實(shí)驗(yàn)：利用細(xì)菌產(chǎn)生的預(yù)成酶（胞外酶），在37℃普通孵箱中與生化試劑基質(zhì)產(chǎn)生特異的酶反應(yīng)，通過(guò)各種指示劑或特殊的顯色產(chǎn)物即可在4小時(shí)～24小時(shí)觀察到結(jié)果。反應(yīng)板微量快速生化實(shí)驗(yàn)的生化鑒定系統(tǒng)包括30個(gè)生化實(shí)驗(yàn)基質(zhì)與相關(guān)指示劑、磷酸鹽緩沖液（PBS）、細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)濁度管以及8個(gè)鑒定系列,可根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)、染色性及耐氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇不同的系列生化基質(zhì)進(jìn)行鑒定。這8個(gè)鑒定系列是： ①

15、革蘭陽(yáng)性厭氧球菌 ②革蘭陰性厭氧球菌 ③革蘭陽(yáng)性無(wú)芽胞厭氧桿菌 ④革蘭陰性無(wú)芽胞厭氧桿菌：a.不產(chǎn)黑色素的革蘭陰性厭氧短桿菌； b.產(chǎn)黑色素的革蘭陰性厭氧短桿菌；c.革蘭陰性厭氧梭狀或長(zhǎng)桿菌 ⑤革蘭陰性彎曲菌 ⑥梭菌屬 ⑦變異鏈球菌和其他口腔鏈球菌 ⑧微需氧的革蘭陰性厭氧桿菌,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),菌種鑒定——變異鏈球菌群細(xì)菌的

16、鑒別：,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：,要設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。細(xì)菌濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 濃度低可導(dǎo)致假陰性結(jié)果，最佳的細(xì)菌濃度為 2.1×1010/ml～2.4×1010/ml,如菌濃度略低可適當(dāng)延長(zhǎng)酶反應(yīng)時(shí)間。酶反應(yīng)時(shí)間與菌種的關(guān)系 酶反應(yīng)時(shí)間因不同菌種有所差異，以4小時(shí)～24 小時(shí)為宜。待測(cè)標(biāo)本放置時(shí)間 以新鮮的放置24小時(shí)～48小時(shí)培養(yǎng)物為宜。如標(biāo)本不能 立即做生化實(shí)驗(yàn)，可將其

17、放置在4℃冰箱內(nèi)，時(shí)間最好不超過(guò)96小時(shí)。預(yù)成酶微量生化實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌應(yīng)來(lái)自不加血的非選擇培養(yǎng)基，以避免產(chǎn)生 假陽(yáng)性結(jié)果。,實(shí)驗(yàn)報(bào)告： 變異鏈球菌的分離與鑒定。思考題： 變異鏈球菌的菌細(xì)胞形態(tài)特征、菌落特征、耐氧特征和生化反應(yīng)特征主要有哪些？,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌代謝酸的測(cè)定,實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求： 學(xué)習(xí)用色譜技術(shù)定性和定量檢測(cè)分析細(xì)菌代謝脂肪酸的基本方法。實(shí)驗(yàn)原理：

18、 各種脂肪酸在色譜柱（固定相）及流動(dòng)相中的分配系數(shù)、吸附能力不同，導(dǎo)致它們?cè)谥械谋Ａ魰r(shí)間有所差異。同種酸停留時(shí)間相同；峰面積與含量正相關(guān)。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1.液體純培養(yǎng)增菌。 2.色譜層析技術(shù)測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液中短鏈脂肪酸的種類(lèi)及相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備、器材等： 色譜儀，細(xì)菌培養(yǎng)箱，離心機(jī)，PH計(jì)，三角燒瓶，接種環(huán)，移液 器，微量注射器和EP管等。,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方法：,

19、樣品制備：,色譜層析：,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析： 結(jié)果計(jì)算： 培養(yǎng)液中各組分保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)酸圖譜比較定性，按下式計(jì)算： C有機(jī)酸 =,注意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)前要用流動(dòng)相平衡分析柱；注意溫度對(duì)分析結(jié)果有影響。

20、,實(shí)驗(yàn)報(bào)告與評(píng)定：細(xì)菌代謝酸測(cè)定。思考題： 色譜層析實(shí)驗(yàn)中哪些方面非常重要？ 細(xì)菌代謝酸的測(cè)定除了采用色譜層析技術(shù)以外，還可以用哪些方法測(cè)定？,Area有機(jī)酸,Area標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn),第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌細(xì)胞外葡聚糖的測(cè)定,實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求： 變異鏈球菌可以產(chǎn)生葡糖基轉(zhuǎn)移酶，綜合蔗糖產(chǎn)生細(xì)胞外多糖即水溶性或不溶水葡聚糖。通過(guò)實(shí)驗(yàn)要掌握用比色法測(cè)定葡聚糖含量的方法和原理。實(shí)驗(yàn)原理：

21、 糖在強(qiáng)酸溶液中加熱，脫水生成羥醛，再變成呋喃衍生物。此衍生 物可以與各種試劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)，然后用分光光度計(jì)測(cè)得密度值，進(jìn)而計(jì)算出糖的含量。以蒽酮法為例,其可與單糖、雙糖、糊精和淀粉反應(yīng)生成有色 化合物，在一定的濃度范圍內(nèi)，測(cè)得的葡聚糖含量與光密度值成正比。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 蒽酮法測(cè)定變異鏈球菌培養(yǎng)液中細(xì)胞外葡聚糖的含量。,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備和器材：蒽酮試劑 稱(chēng)取200mg蒽酮溶解于10

22、0ml濃硫酸中攪拌溶解。4℃冰箱可保存2～3周。葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液 稱(chēng)取1.0g葡聚糖，溶于100ml水中制成儲(chǔ)存液。使用時(shí)吸取1.0ml稀釋至100ml，儲(chǔ)存于4℃冰箱中。分光光度計(jì)，離心機(jī)，10ml試管，恒溫水浴箱，水浴鍋及吸管，移液器，氫氧化鈉等。,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方法：,樣品處理：將水溶性和非水溶性多糖分開(kāi)測(cè)定，即：,測(cè)定：將水溶性和非水溶性多糖分開(kāi)測(cè)定，即：,1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按下表配制標(biāo)準(zhǔn)液。攪拌3分鐘

23、后放入95℃水浴中加熱6分鐘，冷卻，用分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)625nm的光密度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,2. 樣品測(cè)定 取樣品1.0ml(質(zhì)量濃度在20μg/L～40μg/L為宜)，加蒽酮試劑3ml，95℃水浴煮沸6分鐘，冷卻后測(cè)其625nm處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品中葡聚糖的含量。,注意事項(xiàng)： 配置標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)應(yīng)在15℃水浴中加入蒽酮。實(shí)驗(yàn)報(bào)告評(píng)定： 細(xì)菌細(xì)胞外葡聚糖的測(cè)定。 思考題： 細(xì)菌細(xì)胞

24、外多糖有幾種？如何分別檢測(cè)這些細(xì)菌細(xì)胞外多糖？,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)五 菌斑中pH值的測(cè)定,實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求： 菌斑pH的測(cè)定可分為兩大類(lèi)，即活體測(cè)定與離體測(cè)定。 電極接觸法(touch pH electrode method) 活體測(cè)定 埋藏電極遙測(cè)法(intraoral or indwelling pH electrode systems) 離體測(cè)定

25、：如人工菌斑法,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1. 電極接觸法 是活體菌斑pH檢測(cè)法，即將手持的微電極置于原位的菌斑表面來(lái)測(cè)定菌斑的pH。 2. 埋藏電極遙測(cè)法 是體內(nèi)檢測(cè)方法。 3. 人工菌斑法 人工菌斑法是先建立人工菌斑模型，然后用未刺激和刺激的唾液同菌斑作用，同時(shí)電極測(cè)定pH變化。實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備和器材： 微電極，吸液用注射器，pH計(jì)，隔濕用消毒棉球等。,,,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),1.

26、 電極接觸法 是活體菌斑pH檢測(cè)法，即手持微電極測(cè)定菌斑pH的方法。（1）用注射器吸取1ml標(biāo)準(zhǔn)pH溶液，滴入電極敏感端部位，校正pH計(jì)。（2）受試者2天不漱口刷牙，測(cè)試前2小時(shí)不進(jìn)食。（3）用棉卷隔濕并用氣槍吹干測(cè)試部位。（4）測(cè)定“靜態(tài)”pH：手持微電極置于原位的菌斑表面，待離子計(jì)數(shù)穩(wěn)定時(shí)記錄pH值。每一時(shí)間點(diǎn)測(cè)試受試者同一顆牙的上下左右4個(gè)位點(diǎn)，取其平均值即為菌斑原位pH值，且4個(gè)位點(diǎn)在1分鐘內(nèi)完成測(cè)試。（5）測(cè)定

27、動(dòng)態(tài)pH：受試者可先測(cè)定靜態(tài)PH值；再讓受試者進(jìn)食不同的食物，在一定的時(shí)間間隔中測(cè)定動(dòng)態(tài)pH；也可分別測(cè)定齲齒敏感部及鄰牙界面的PH。（6）測(cè)試操作： ① 測(cè)定時(shí)，將微型玻璃電極或銻電極直接插入要測(cè)的牙菌斑中； ② 參比電極通過(guò)飽和氯化鉀鹽橋與受檢者身體相連，多放在前臂或口底； ③ pH計(jì)也可連接自動(dòng)描繪裝置，將測(cè)到的pH直接繪制成圖。,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),2.埋藏電極遙測(cè)法 是菌斑pH的體

28、內(nèi)檢測(cè)方法。（1）用注射器吸取1ml標(biāo)準(zhǔn)pH溶液滴入電極敏感端部，校正pH計(jì)。（2）將一個(gè)微型玻璃電極埋入離體的釉質(zhì)小塊中。（3）用棉卷隔濕并用氣槍吹干測(cè)試區(qū)域。（4）將埋入釉質(zhì)小塊中的微型玻璃電極放入局部義齒中，戴入受檢者口腔內(nèi)缺牙的部位，讓電極的敏感面向著基牙的鄰面和咬合面。也可在電極的后方接一個(gè)微型的場(chǎng)效應(yīng)晶體管，以增加傳導(dǎo)速度，提高敏感性，減少干擾。（5）參比電極的接法一般與接觸法相同，或者也埋入義齒中，以細(xì)導(dǎo)線與口外

29、連接。（6）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求觀察菌斑在電極頭的聚集和pH變化情況。（7）電極敏感端的菌斑可以確定為類(lèi)似于鄰面或窩溝部位的牙菌斑。,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),3. 人工菌斑法 是先建立人工菌斑模型，然后用未刺激和刺激的 唾液同菌斑作用，同時(shí)用電極測(cè)定pH變化。在整個(gè)測(cè)試過(guò)程中，人工唾液均處于流動(dòng)狀態(tài)，且流速可變。,實(shí)驗(yàn)報(bào)告評(píng)定： 菌斑中pH值的測(cè)定。思考題： 三種測(cè)試pH的方法各有何優(yōu)缺點(diǎn)？,注意事項(xiàng)： 菌

30、斑中pH值受多方面因素的影響，如口腔環(huán)境、唾液、飲食的 酸堿度以及口腔清潔情況等，因此測(cè)定時(shí)要做好隔濕防護(hù)。,第一節(jié) 口腔微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求： 牙周炎處齦溝液中該酶的活性變化與牙周袋探診深度和炎癥程度明顯正相關(guān)，與牙周炎破壞和牙周組織狀況相關(guān)。通過(guò)實(shí)習(xí)要求掌握齦溝液中ALP的基本檢測(cè)方法。 實(shí)驗(yàn)原理：——ELISA法定量測(cè)定ALP,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1.齦溝液樣品采集與制備

31、； 2.ELISA法測(cè)定ALP的染色操作； 3.酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，確定ALP的相對(duì)含量。,實(shí)驗(yàn)六 齦溝液中堿性磷酸酶活性的測(cè)定,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),齦溝液采集,洗提,ELISA法檢測(cè)ALP,酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值,,,,實(shí)驗(yàn)方法：,主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備和器材：,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),注意事項(xiàng)：齦溝液的量少，易受多種因素影響，采集時(shí)動(dòng)作要輕柔，排除全身影響因素（如生理周期、性激素等）和局部刺激因素，并注

32、意防止污染。每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔(不同于空白孔)，測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。嚴(yán)格按規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行孵育。所有試劑必須在用前恢復(fù)至室溫；用后應(yīng)立即冷藏。洗板很重要，在加入檢測(cè)溶液B或底物前要盡量吸干孔內(nèi)液體，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。實(shí)驗(yàn)時(shí)酶標(biāo)板加蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，避免酶標(biāo)板長(zhǎng)時(shí)間處于干燥狀態(tài)。,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),注意事項(xiàng)：操作時(shí)要帶手套，板底勿殘留的液體和手指印，否則

33、影響OD值的準(zhǔn)確性。在儲(chǔ)存和孵育時(shí)要避免強(qiáng)光直接照射，底物避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。未用完的酶標(biāo)板或試劑務(wù)必于2℃～8℃保存，避免不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差；檢測(cè)液及底物溶液要在用前配制，且應(yīng)37℃溫育30分鐘。加樣或加試劑時(shí)，應(yīng)注意減少時(shí)間間隔，以保證準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品)最好控制在10分鐘以?xún)?nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)

34、確性。,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析： 根據(jù)齦溝液中ALP含量檢測(cè)的OD值結(jié)果、空白對(duì)照等，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。思考題： 哪些因素能影響齦溝液中堿性磷酸酶的含量測(cè)定？,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)七（1）唾液鈣含量的測(cè)定,目的和要求：了解分光光度法的定量原理，熟悉減少實(shí)驗(yàn)誤差、提高準(zhǔn)確度的方法和操作技術(shù)，掌握利用市售試劑盒測(cè)定唾液中鈣濃度的原理和方法。,實(shí)驗(yàn)原理：,實(shí)驗(yàn)主要用品和設(shè)備：,第二節(jié)

35、 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方法：1. 唾液收集及處理 收集非刺激性唾液約0.5ml，3000r/min離心10min，取上清液備測(cè)。2. 分光光度計(jì)測(cè)定 準(zhǔn)備三組EP管，按下表順序分別加入試劑： 3.各管在振蕩器上混勻，以空白管校正零點(diǎn)，在分光光度計(jì)上測(cè)定612nm波長(zhǎng)下的OD值，按下式計(jì)算含量： 樣品中鈣的濃度（mmol/L)=樣品管光密度/標(biāo)準(zhǔn)管光密度×2

36、.5,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),思考題： 試分析誤差產(chǎn)生的原因？含量計(jì)算的方法有哪些？,注意事項(xiàng)：為保證測(cè)試結(jié)果的可靠性，所有實(shí)驗(yàn)器皿一定要清洗干凈且用三蒸水多次沖洗、烤干后待用。也可在試劑中加入少量的 EDTA 作掩蔽劑，消除實(shí)驗(yàn)器皿和試劑中的鈣污染，在試劑中加入8-羥基喹嚀以去除鎂的干擾。為避免玻璃中的鈣離子溶出，鈣標(biāo)準(zhǔn)貯存液用塑料瓶保存。為提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，減少偶然誤差，應(yīng)增加平行測(cè)定次數(shù)。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)結(jié)果為

37、唾液中總鈣濃度。,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)七（2） 唾液中磷含量測(cè)定,目的和要求：了解分光光度法的定量原理，熟悉減少實(shí)驗(yàn)誤差、提高準(zhǔn)確度的方法和操作技術(shù)，掌握比色法測(cè)定唾液中磷含量的原理和方法。,實(shí)驗(yàn)原理：,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1.收集口腔唾液； 2.測(cè)定唾液中總鈣含量。實(shí)驗(yàn)設(shè)備和用品：,硫酸,還原,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方法和步驟：,1. 標(biāo)本收集及處理 收集非刺激性唾液0.5ml，取0.

38、2ml，加10%三氯 醋酸3.8ml，充分混勻，放置10min，3000r/min離心10min，取上清液備測(cè)。2. 測(cè)定 準(zhǔn)備三組EP管，按表7-4順序分別加入試劑：,3. 結(jié)果計(jì)算 C唾液（mg/ml）=A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)=A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)×0.005(mg/ml),第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),注意事項(xiàng)：為了保證測(cè)試結(jié)果的可靠性，所有實(shí)驗(yàn)器皿一定要清洗干凈 且用三蒸水多次沖洗

39、，烤干后待用。為了避免玻璃中的磷離子溶出，磷標(biāo)準(zhǔn)貯存液用塑料瓶保存。為了提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，減少偶然誤差，應(yīng)增加平行測(cè)定次數(shù)。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)結(jié)果為唾液中總磷濃度。,思考題： 1. 唾液中磷含量測(cè)定誤差的種類(lèi)有哪些？ 2. 含量計(jì)算的方法有哪些？,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)八 唾液分泌情況的測(cè)定,實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求： 唾液分泌量及成分的測(cè)定對(duì)一些疾病診治效果的評(píng)估有重要意義。通過(guò)實(shí)習(xí)要求

40、掌握靜態(tài)流率和靜態(tài)流率的測(cè)量意義和方法，掌握單個(gè)腺體分泌測(cè)定的方法，為將來(lái)臨床研究奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1. 靜態(tài)唾液總流率的測(cè)定； 2. 動(dòng)態(tài)唾液總流率的測(cè)定； 3. 單個(gè)腺體唾液分泌的測(cè)定。材料、用品及設(shè)備： 消毒的帶漏斗試管和普通試管，無(wú)菌棉球或棉墊，天平，色層分析紙，Lashley杯，0.1mol/L枸櫞酸(或1g膠姆，或方糖等)。,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方法：1.

41、 靜態(tài)唾液總流率測(cè)定 常用測(cè)定方法包括：吸取法(draining)：手持帶漏斗的試管，使唾液沿下唇逐漸流入試管，至結(jié)束時(shí)，受試者將口內(nèi)剩余唾液全部吐入試管。通常收取15分鐘，計(jì)算單位時(shí)間的唾液量。吐取法(spitting)：使唾液在口底聚集，受試者每隔60秒將其吐入試管，一般收集10分鐘，低于1ml/10min為異常減低。吸引法(suction)：用負(fù)壓吸引器將唾液自口底持續(xù)吸入試管，吸引頭置于舌下。棉墊法(swab)：將

42、每個(gè)約0.24cm×0.6cm的棉墊預(yù)先稱(chēng)重，置于口內(nèi)各唾液腺導(dǎo)管開(kāi)口處，收集后稱(chēng)重。吐取法及吸取法相對(duì)常用，操作簡(jiǎn)便，還可用于動(dòng)態(tài)唾液總流率的測(cè)定。而吸引法和棉墊法會(huì)產(chǎn)生一定刺激，操作相對(duì)復(fù)雜，目前多不使用。,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方法：2. 動(dòng)態(tài)唾液總流率測(cè)定 常用測(cè)定方法包括：酸刺激法：將0.1mol/L枸櫞酸滴于舌背前部，每次4滴，受試者將舌尖后卷，分泌唾液用吐取法收集一般測(cè)5分鐘～10分鐘。咀嚼

43、刺激法：將1g膠姆以每分鐘20次的頻率咀嚼10分鐘,低于10ml/10min為異常低下；或用5g醫(yī)用白蠟，溫水泡軟后咀嚼6分鐘，低于6ml/6min為異常低下。方糖法：取方糖1.5cm×1.5cm置于舌背上，勿動(dòng)，正常情況下15分鐘～30分鐘方糖全部溶化，否則認(rèn)為分泌功能低下。酸刺激法可能影響唾液的緩沖容量和pH等。,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方法：3. 動(dòng)態(tài)唾液總流率測(cè)定 包括腮腺、下頜下腺與舌下腺的測(cè)定。常

44、用測(cè)定方法包括：腮腺唾液分泌測(cè)定：用Lashley杯吸附于頰黏膜的導(dǎo)管開(kāi)口處，靜止腮腺流率變異較大，而酸刺激流率低于1ml/5min為異常低下。下頜下腺與舌下腺唾液分泌測(cè)定：因兩腺體常共同開(kāi)口于口腔，所以測(cè)定分泌時(shí)常收集在一起，常用插管法和隔離法。小唾液腺唾液分泌測(cè)定：通常用色層分析紙收集，擦干局部黏膜后貼于黏膜2分鐘后，用濕度儀測(cè)其含水率。,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)報(bào)告與評(píng)定：靜態(tài)唾液總流率或動(dòng)態(tài)唾液總流率，或單個(gè)腺體

45、分泌情況分析。思考題： 靜態(tài)唾液流率測(cè)定和動(dòng)態(tài)唾液流率測(cè)定應(yīng)該注意些什么？各應(yīng)用于何種情況下？,注意事項(xiàng)：使用咀嚼法測(cè)定唾液腺分泌時(shí)不影響唾液成分，相對(duì)比較常用，但要注意保持恒定的咀嚼頻率。單個(gè)腺體唾液收集方法較復(fù)雜，且不能反映所有唾液腺總的分泌狀況，在評(píng)價(jià)整個(gè)唾液腺功能時(shí)有局限性，不過(guò)在測(cè)定唾液成分時(shí)因污染少而多采用此方法。,第二節(jié) 口腔生物化學(xué)實(shí)驗(yàn),第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué),實(shí)驗(yàn)九 以釉原蛋白基因進(jìn)行性別鑒定,實(shí)

46、驗(yàn)?zāi)康呐c要求： 通過(guò)此實(shí)驗(yàn)學(xué)會(huì)PCR檢測(cè)技術(shù)，包括DNA提取、分光光度計(jì)的使用、引 物設(shè)計(jì)的原則、PCR擴(kuò)增的條件設(shè)定，以及電泳和測(cè)序結(jié)果分析等。實(shí)驗(yàn)原理： 針對(duì)Amelogenin基因內(nèi)含子1區(qū)x染色體上6bp缺失的特性，采用一對(duì)x、 Y同源引物擴(kuò)增，男性個(gè)體同時(shí)得到x染色體Amelogenin等位基因特異 性段(簡(jiǎn)稱(chēng)Am X，106 bp或212 bp)和Y染色體Amelo

47、genin等位基因特異 性片段(簡(jiǎn)稱(chēng)Am Y，112bp或218 bp)，分型結(jié)果表現(xiàn)出兩條譜帶；而女 性?xún)H有Am X(106 bp或212 bp)，分型表現(xiàn)為一條譜帶，因此鑒定性別。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué),實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材：,5ml無(wú)菌試管（含肝素抗凝劑）；PowerPlex M16 system DNA提取試劑盒，Am 基因上游引物和下游引物，2×Taq PCR MasterMi

48、x；20bp DNA Ladder Marker；DNA片段快速純化試劑盒。,實(shí)驗(yàn)方法：,樣品采集,采集靜脈血5ml于無(wú)菌抗凝管中,DNA 提取和含量檢測(cè),,,性別鑒定,PCR 擴(kuò)增、凝膠電泳、純化測(cè)序,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué),實(shí)驗(yàn)方法：,DNA 提取和含量檢測(cè)：,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué),實(shí)驗(yàn)方法：,性別鑒定——PCR 擴(kuò)增、凝膠電泳、純化測(cè)序PCR 擴(kuò)增：PCR反應(yīng)引物序列如下：上游引物( 5‘- CCCTGG GC

49、T CTG TAA AGA ATA GTG-3’)，下游引物( 5‘-ATC AGA GCT TAA ACT GGG AAG CTG－3’)；模板DNA為上述血液所獲樣品的DNA提取液。PCR 反應(yīng)體系為25μL，其中2×Taq PCRMasterMix 12.5μl，上下游引物( 1μmol /L)各1μl，無(wú)菌雙蒸水9.5μl，模板DNA 1μl。PCR 反應(yīng)參數(shù): 95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，60℃退火3

50、0秒，72℃延伸30秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘。凝膠電泳：制備濃度為3g/L的瓊脂糖凝膠，置1×TAE電泳緩沖液中，電泳條件為: 電壓100V，電泳時(shí)間120分鐘。電泳結(jié)果放入凝膠成像儀中進(jìn)行觀察。純化測(cè)序：將瓊脂糖凝膠上的特異性條帶切下純化、回收、測(cè)序。,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué),結(jié)果分析：,M-marker；1、2-陰性對(duì)照；3、5-女性；4-男性,實(shí)驗(yàn)報(bào)告評(píng)定： PCR擴(kuò)增后凝膠電泳和測(cè)

51、序結(jié)果分析評(píng)定。思考題： 1.PCR檢測(cè)分析技術(shù)中最重要的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有哪些？ 2.PCR實(shí)驗(yàn)中容易出問(wèn)題的操作有哪些？應(yīng)該如何避免？,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué),注意事項(xiàng)：引物 引物是PCR反應(yīng)的關(guān)鍵，其特異性取決于引物與模板DNA的互補(bǔ)程度。引物的長(zhǎng)度最好為15bp～30bp；引物擴(kuò)增跨度以200bp～500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)度至10kb的片段；其中G+C含量以40%～60%為宜，ATGC最好

52、隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)或兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)；3’端的堿基，尤其最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)；引物中有或最好加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)；引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性；每條引物的濃度0.1μmol～1μmol或10pmol～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好。PCR 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增的程度

53、。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30次～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，但非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。設(shè)立對(duì)照 PCR反應(yīng)應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要參考指標(biāo)。,第三節(jié) 口腔疾病分子生物學(xué),第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)十 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求： 掌握分離、培養(yǎng)和鑒定成骨細(xì)胞方法，了解成骨細(xì)胞的功能與

54、特性。實(shí)驗(yàn)原理： 成骨細(xì)胞一個(gè)明顯特征是可形成礦化結(jié)節(jié)，故采用Von Kossa染色法對(duì)成骨細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 成骨細(xì)胞的收集、培養(yǎng)和鑒定。實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備與器材：,第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)方法： 采用酶消化法無(wú)菌下分離獲取幼兔成額、頂骨→分離成骨細(xì)胞→體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞→觀察、鑒定成骨細(xì)胞：形態(tài)、鈣化能力測(cè)定。,1. 成骨細(xì)胞的收集,出生十天內(nèi)的大耳白兔清洗、75

55、%酒精浸泡消毒5分鐘→剪開(kāi)皮膚后環(huán)行剪下顱骨(頂骨及額骨)→用含500U/ml青霉素、500 μg/ml 鏈霉素的無(wú)菌PBS液沖洗三次→用剪刀和鑷子剔除結(jié)締組織和血管→剪碎成1mm3大小→用0.25%胰蛋白酶37°C預(yù)消化20分鐘→加含0.2%的Ⅰ型膠原酶和0.1%的透明質(zhì)酸酶消化（共消化5次，每次在37°C恒溫震蕩20分鐘） →取第3、4、5次消化的細(xì)胞懸液300g離心10分鐘→棄上清→沉淀的細(xì)胞用不含血清的α-M

56、EM培養(yǎng)基洗滌離心→用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液重懸→吹打均勻后以1×105/ml密度接種到培養(yǎng)皿→置于37°C 、5%CO2培養(yǎng),第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng),2. 成骨細(xì)胞的培養(yǎng)（1）24 小時(shí)后可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，更換新鮮含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液。以后每隔48小時(shí)換液一次。（2）待細(xì)胞長(zhǎng)滿至70%～80%，用0.25%胰蛋白酶消化，使貼壁細(xì)胞消化松解、變圓后吸出消化液，加入含10

57、%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液終止消化。（3）輕輕吹打細(xì)胞，待其脫壁后調(diào)至相應(yīng)的細(xì)胞密度，移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)后的繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。3. 成骨細(xì)胞的鑒定（1）用倒置相差顯微鏡觀察成骨細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。 （2）茜素紅（Alizarin Red）染色觀察礦化結(jié)節(jié)（3）改良Gomori鈣鈷法——堿性磷酸酶(ALP)染色,第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng),結(jié)果分析：倒置顯微鏡下觀察：成骨細(xì)胞從球形、懸浮狀到梭形、三角形或多角形梭形

58、或鱗片狀，有較多突起逐漸可見(jiàn)基質(zhì)堆積、結(jié)節(jié)、鈣化結(jié)節(jié)形成。礦化結(jié)節(jié)觀察：茜素紅染成橘紅色顆粒狀。ALP染色成骨細(xì)胞胞漿呈黑色。,鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色不同時(shí)間的變化,思考題：除茜素紅染色法外，還有什么方法可以鑒定獲得的細(xì)胞屬于成骨細(xì)胞？成骨細(xì)胞的功能與破骨細(xì)胞有關(guān)嗎？如何提高成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)的成功率？,注意事項(xiàng):2%硝酸鈣、2%硝酸鈷和1%硫化銨要用前新鮮配制。,第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)十一 破骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)

59、,實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求： 破骨細(xì)胞是高度分化的多核巨細(xì)胞，是骨組織吸收時(shí)的功能細(xì)胞。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，要求學(xué)會(huì)從幼年動(dòng)物骨內(nèi)分離和培養(yǎng)和觀察破骨細(xì)胞的基本技術(shù)，了解鑒定破骨細(xì)胞的主要方法。實(shí)驗(yàn)原理： 已知機(jī)體的破骨細(xì)胞來(lái)源于單核-吞噬系統(tǒng)的骨髓干細(xì)胞，所以可以從機(jī)體年輕骨髓中分離獲得該細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1. 從年幼的動(dòng)物的長(zhǎng)管骨或顱蓋骨分離破骨細(xì)胞； 2. 培養(yǎng)和觀察破骨細(xì)胞； 3. 破骨細(xì)胞的鑒定。

60、,第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)方法：1. 分離破骨細(xì)胞取新出生的白兔5只用肥皂水洗滌三次→清水沖凈→斷頭處死→浸泡于75%乙醇中1分鐘→去皮分離股骨、肱骨、脛骨和顱蓋骨→置盛有60ml Hanks液的培養(yǎng)皿 →刮除軟組織及軟骨骺→置Hanks液洗2次→移入12ml含有抗生素的199培養(yǎng)液縱行剖開(kāi)骨→以手術(shù)刀輕刮骨的內(nèi)表面→用尖吸管反復(fù)吸取培養(yǎng)液沖洗骨髓腔內(nèi)表面至色發(fā)白為止→靜置1分鐘，取懸液備用。,主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備與

61、器材：,第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng),2. 骨片制備將放至-70?C冰箱中儲(chǔ)存的牛股骨取出，在沖水降溫的條件下分切成6mm ×6mm×0.2mm大小的骨片，并用不同粗細(xì)的砂紙磨成10μm厚。將骨片置生理鹽水中于超聲波清洗器上處理5分鐘×3次。將超聲處理后的骨片浸入含抗生素的199培養(yǎng)液中浸泡5分鐘～10分鐘×3 次。3. 破骨細(xì)胞培養(yǎng) 取24孔板，孔內(nèi)分別放入骨片和蓋玻片，并分

62、別加入1ml199培養(yǎng)液，置5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫預(yù)熱1小時(shí)。每孔加入0.5ml上述制備的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)15小時(shí)～20小時(shí)后，吸去懸液，用199培養(yǎng)液沖洗未貼壁的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察骨片被吸收的情況，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)、骨片吸收情況和實(shí)驗(yàn)需要，決定培養(yǎng)終止時(shí)間。4. 破骨細(xì)胞鑒定 用倒置相差顯微鏡或電鏡觀察；酸性磷酸酶或降鈣素染色后鑒定。,第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng),4. 破骨細(xì)胞鑒定 （1）倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)破骨

63、細(xì)胞的形態(tài)； （2）HE染色：生長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片分別于3天～7天取出，80%乙醇固定，HE染色，脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片，光鏡觀察； （3）甲苯胺蘭染色：將細(xì)胞蓋玻片置甲醇中固定10分鐘，1%甲苯胺蘭染色3分鐘，95%乙醇分色、蒸餾水沖凈，空氣干燥后二甲苯透明、樹(shù)膠封片，光鏡觀察； （4）抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色進(jìn)行破骨細(xì)胞鑒定：將細(xì)胞爬片置37℃溫箱中5分鐘干燥后，置2.5%的戊二醛中4℃固定10分鐘，然后用孵育液溫

64、育至37℃，雙蒸水洗3次，蘇木素復(fù)染2分鐘，自來(lái)水沖洗反藍(lán)，晾干、二甲苯透明、樹(shù)膠封固，光鏡觀察。,第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng),（5）破骨細(xì)胞骨吸收活動(dòng)的觀察：甲苯胺蘭染色：培養(yǎng)的第7天取出培養(yǎng)板中的骨片，2.5%戊二醛固定7分鐘，于0.25mmol/L氫氧化銨中超聲清洗5分鐘×3次，系列酒精脫水，自然晾干，含1%硼酸鈉的1%甲苯胺藍(lán)染色3分鐘，自然晾干后光學(xué)顯微鏡下觀察。用掃描電鏡觀察破骨細(xì)胞在骨磨片上形成的

65、骨吸收陷窩：經(jīng)破骨細(xì)胞培養(yǎng)至10天的骨片以0.25 mol/L氫氧化銨超聲處理10 分鐘，清除骨片上的破骨細(xì)胞，再以2.5%戊二醛固定、1%鋨酸固定、酒精系列脫水、 醋酸異戊酯置換酒精后，二氧化碳臨界點(diǎn)干燥、噴金后掃描電鏡觀察。,第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng),倒置相差顯微鏡可見(jiàn)骨片上破骨細(xì)胞吸收陷窩,破骨細(xì)胞TRAP染色胞漿呈紅色,結(jié)果分析與實(shí)驗(yàn)報(bào)告評(píng)定：破骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定,注意事項(xiàng):破骨細(xì)胞在體外具有形成骨吸收陷窩的

66、功能，但是由于其是終末分化細(xì)胞，不能分裂，故其分離、培養(yǎng)一般只能存活10天以?xún)?nèi)；可以觀察破骨細(xì)胞與骨片共培養(yǎng)后1天～10天內(nèi)的不同時(shí)間的變化。由于破骨細(xì)胞的生活習(xí)性是貼壁生長(zhǎng)，所以分離破骨細(xì)胞時(shí)，要使用胰蛋白酶進(jìn)行消化，去除周邊的成纖維細(xì)胞，只留下貼壁的破骨細(xì)胞，才能使破骨細(xì)胞得以充分伸展和移動(dòng)，也才能使其功能研究便于觀察。,第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求： 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)要求掌握用MTT法測(cè)定細(xì)

67、胞增殖活性的基本方法，學(xué)會(huì)使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，應(yīng)用生物軟件或Excel繪制實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，并了解解析結(jié)果的意義。實(shí)驗(yàn)原理： 活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在波長(zhǎng)490nm處的吸收光值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定數(shù)量范圍內(nèi)，100U/ml MTT結(jié)晶形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比。

68、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： MTT法測(cè)定不同濃度藥物如尼古丁對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響； 用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值； 應(yīng)用生物軟件或Excel繪制實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，解析結(jié)果的意義。,實(shí)驗(yàn)十二 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性,第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備和器材：,實(shí)驗(yàn)方法：,第四節(jié) 骨組織生物學(xué)和口腔細(xì)胞培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)方法：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113稀釋成2.5×104個(gè) /ml后，接種于96孔板，每

69、孔200μl，置5%CO2、37?C恒溫培養(yǎng)24小時(shí)至細(xì)胞貼壁。吸棄培養(yǎng)液，加入不同濃度梯度的尼古?。?μM、0.01μM、0.1μM、1μM），每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以0μM 者為陰性對(duì)照，置5%CO2、 37?C恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入5mg/mlMTT試劑20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。輕輕吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150μl，錫紙包裹孔板15分鐘后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行比色，讀取并記錄波長(zhǎng)490nm下的每孔OD值。按照下式計(jì)算細(xì)