醫(yī)械生物學(xué)評價實(shí)驗(yàn)

1、醫(yī)療器械生物學(xué)評價試驗(yàn)介紹,山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心 生物學(xué)評價室王昕2017年10月,醫(yī)療器械生物學(xué)評價相關(guān)規(guī)章,國家食品藥品監(jiān)督管理總局2014年第43號《關(guān)于公布醫(yī)療器械注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》,醫(yī)療器械生物相容性評價研究,應(yīng)對成品中與患者和使用者直接或間接接觸的材料的生物相容性進(jìn)行評價。,生物相容性評價研究資料應(yīng)當(dāng)包括：,1.生物相容性評價的依據(jù)和方法。 2.產(chǎn)品所用材料的描述及與人體接觸的性質(zhì)。

2、 3.實(shí)施或豁免生物學(xué)試驗(yàn)的理由和論證。 4.對于現(xiàn)有數(shù)據(jù)或試驗(yàn)結(jié)果的評價。,醫(yī)療器械生物學(xué)評價系列標(biāo)準(zhǔn),GB/T16886.1-20部分GB/T16886.1風(fēng)險管理過程中的評價與試驗(yàn),5,GB/T 16886 《醫(yī)療器械生物學(xué)評價》 系列標(biāo)準(zhǔn),GB/T 16886 《醫(yī)療器械生物學(xué)評價》 系列標(biāo)準(zhǔn),GB/T16886.18材料化學(xué)表征GB/T16886.19材料物理化學(xué)形態(tài)學(xué)和表面特性表征GB/T16886.20醫(yī)療器械免

3、疫毒理學(xué)試驗(yàn)原則和方法,8,,依據(jù)GB/T16886/ISO10993系列標(biāo)準(zhǔn)基本原則制定了兩項(xiàng)醫(yī)療器械生物學(xué)試驗(yàn)方法的國家標(biāo)準(zhǔn)：GB/T14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法GB/T16175-2010醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評價試驗(yàn)方法,1.基本評價試驗(yàn),細(xì)胞毒性---GB/T16886.5刺激或皮內(nèi)反應(yīng)（皮膚、 皮內(nèi)、眼、口腔、陰道、直腸、陰莖）---GB/T16886.10致敏

4、---GB/T16886.10血液相容性（血栓、凝血、血小板、溶血、補(bǔ)體、血液學(xué)）---GB/T16886.4植入試驗(yàn)（皮下、肌肉、骨）---GB/T16886.6 全身毒性（急性全身毒性、重復(fù)接觸全身毒性）---GB/T16886.11遺傳毒性(AEMS、染色體畸變試驗(yàn)、小鼠淋巴瘤）---GB/T16886.3,2.補(bǔ)充評價試驗(yàn),（1）慢性毒性—口、吸入、經(jīng)皮、靜脈、腹膜、植入途徑。 （2）致癌性。 （3）生殖和發(fā)育毒性。

5、 （4）生物降解—聚合物、金屬、合金、陶瓷。,醫(yī)療器械生物學(xué)試驗(yàn)樣品制備,參考標(biāo)準(zhǔn)：GB/T16886.12-2005（ISO10993-12:2002)試驗(yàn)樣品的選擇和制備標(biāo)準(zhǔn)化是保證生物學(xué)評價試驗(yàn)結(jié)果可靠性和可比性的很關(guān)鍵的一步。在進(jìn)行試驗(yàn)以及解釋試驗(yàn)結(jié)果時，應(yīng)考慮器械在人體應(yīng)用時的接觸性質(zhì)、程度、頻率、時間和條件等因素，其中最關(guān)鍵的因素之一就是試驗(yàn)樣品的制備。當(dāng)制備器械浸提液時，所用的浸提介質(zhì)和浸提條件應(yīng)該既與最終產(chǎn)品的性

6、質(zhì)和用途相適應(yīng)，又要與試驗(yàn)方法的可預(yù)見性（如試驗(yàn)?zāi)康?、原理、敏感性等）相適應(yīng)。因此理想的浸提條件和試驗(yàn)系統(tǒng)浸提液的應(yīng)用既要反映產(chǎn)品的實(shí)際使用條件，還要反映試驗(yàn)的目的和預(yù)測性。,醫(yī)療器械生物學(xué)試驗(yàn)樣品的選擇,1. 應(yīng)采用最終產(chǎn)品、最終產(chǎn)品中有代表性的樣品或與最終產(chǎn)品相同的工藝過程制得的材料以及它們的浸提液進(jìn)行試驗(yàn)。選擇的樣品必須被證明合理。2. 處置試驗(yàn)樣品與參照樣品時應(yīng)謹(jǐn)防污染。來自制造過程的任何殘留物應(yīng)視為器械、器械部件或組件的構(gòu)成

7、部分。（1） 試驗(yàn)樣品如取自非無菌狀態(tài)，但要求使用前滅菌的器械，試驗(yàn)樣品應(yīng)按照制造廠家推薦的滅菌方法滅菌，必要時，試驗(yàn)應(yīng)采取無菌操作。（2）如果試驗(yàn)樣品在滅菌前清洗，應(yīng)考慮清洗過程和清洗劑對試驗(yàn)樣品選擇和處置方面的影響。3．如果試驗(yàn)過程要求無菌試驗(yàn)樣品，應(yīng)考慮滅菌或再滅菌過程對試驗(yàn)樣品和參照材料的影響。4．當(dāng)試驗(yàn)樣品和參照材料需要分割成小片時，應(yīng)考慮原先沒有暴露的表面（如腔或切面）的影響。,醫(yī)療器械生物學(xué)試驗(yàn)樣品的選擇,6. 從

8、器械選擇有代表性的部分（1）如器械不能以整體用于試驗(yàn)時，應(yīng)選取最終產(chǎn)品中各種材料有代表性的部分按比例組合成試驗(yàn)樣品。（2）有表面涂層器械的試驗(yàn)樣品應(yīng)包括涂層材料和基質(zhì)材料，即使基質(zhì)材料沒有和組織接觸。（3）與病人接觸的器械部件在制造過程中如使用了粘結(jié)劑、射頻密封或溶劑密封，試驗(yàn)樣品則應(yīng)包括粘接和/或密封處有代表性的部分。（4）復(fù)合材料應(yīng)作為最終材料進(jìn)行試驗(yàn)。（5）當(dāng)一個器械由不同的材料組成，在選擇試驗(yàn)樣品時，應(yīng)考慮其潛在的協(xié)同

9、作用和相互作用。（6）選擇的試驗(yàn)樣品應(yīng)能使器械組件最大限度地與試驗(yàn)系統(tǒng)接觸，以了解潛在的生物學(xué)。,浸提條件和方法,浸提溫度浸提時間浸提比例浸提介質(zhì),浸提溫度和浸提時間,可采用下列的一個條件進(jìn)行浸提：(37±1)℃，（72±2）h；(50±2)℃，（72±2）h；(70±2)℃，（24±2）h；(121±2)℃，（1±0.1）h；,注：,在多數(shù)

10、情況下為產(chǎn)品使用適宜的加嚴(yán)條件。對于細(xì)胞毒性試驗(yàn)，含血清的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)可在(37±1)℃，（24±2）h條件下浸提。采用高溫浸提時應(yīng)注意：可能會導(dǎo)致聚合物的交聯(lián)和/或聚合作用增強(qiáng)； 可能會引起材料明顯出現(xiàn)降解。可降解材料浸提時要用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)、時間、溫度條件來模擬盡可能的過度暴露。完全的溶解是適當(dāng)?shù)摹?標(biāo)準(zhǔn)表面積和浸提液體積,,注：,標(biāo)準(zhǔn)的表面積包括樣品兩面和連接處的面積，不包括不確定表面的不規(guī)則面

11、積。當(dāng)由于樣品外形不能確定其表面積時，浸提時可使用質(zhì)量/體積。浸提之前應(yīng)將材料切成小塊，以使材料浸沒在浸提介質(zhì)中。 由于完整表面與切割表面存在潛在的浸提差異，因此對于彈性體、涂層材料、復(fù)合材料、層狀薄片等應(yīng)盡量采用完整的樣品進(jìn)行試驗(yàn)。,浸提介質(zhì),浸提介質(zhì)示例：極性介質(zhì)：水、生理鹽水、無血清培養(yǎng)皿；非極性介質(zhì)：各國藥典中規(guī)定的新鮮精制植物油（如棉籽油或芝麻油）；其余介質(zhì)：乙醇/水、乙醇/生理鹽水、聚乙二醇400（稀釋至生理滲透壓

12、）、二甲基亞砜和含血清培養(yǎng)基。,浸提液制備的注意事項(xiàng),浸提應(yīng)在攪拌的條件下進(jìn)行。當(dāng)認(rèn)為靜態(tài)適宜時，應(yīng)對試驗(yàn)方法加以論證、規(guī)定并出具報告。如可能, 液體浸提液應(yīng)在制備后立即使用, 以防止吸附在浸提容器上或成分發(fā)生其他變化。不應(yīng)調(diào)整浸提液的ph值除非給出理由。浸提液一般不應(yīng)采用過濾、離心或其他方法來去除懸浮的粒子，如果必須進(jìn)行時，應(yīng)說明其理由。,浸提液制備的注意事項(xiàng),對于在使用條件下不是可溶解和再吸收的材料和器械，進(jìn)行浸提的任何溶劑不

13、應(yīng)導(dǎo)致聚合物發(fā)生分解。聚合材料在揮發(fā)性溶劑中只應(yīng)發(fā)生輕微變軟（如小于10%的溶解度）。如果器械是不能浸提的水狀液體，可用液體直接進(jìn)行試驗(yàn)。在正規(guī)使用條件下液體是在器械內(nèi)循環(huán)，可以采用循環(huán)方式進(jìn)行浸提，盡可能加大一個或多個實(shí)驗(yàn)條件，如溫度、時間、體積、流速。選擇這種浸提方式的基本原理應(yīng)該在報告中注明。,,細(xì)胞毒性試驗(yàn),細(xì)胞毒性試驗(yàn),現(xiàn)有版本是GB/T16886.5-2005（ISO10993-1999），GB/T16886.5-20x

14、x（ISO10993-2009）正在報批中。敏感性高、重現(xiàn)性好，結(jié)果有一定的臨床相關(guān)性，因此被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療器械生物學(xué)評價中，特別是作為新材料篩選時的必做試驗(yàn)。國內(nèi)外無論哪項(xiàng)醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)中都把細(xì)胞毒性試驗(yàn)列為首位，作為首選項(xiàng)目。,概述,定義：該試驗(yàn)采用已建立的細(xì)胞系（ATCC CCL1(NCTC clone 929)）, 測定由器械、材料和/或其浸提液造成的細(xì)胞溶解(細(xì)胞死亡)、以及對細(xì)胞生長的抑制和其他影響。意義：該試

15、驗(yàn)屬體外試驗(yàn)，能在短期內(nèi)檢出供試品對細(xì)胞新陳代謝功能的影響，對毒性物質(zhì)具有較高的敏感性，從而能快速篩選材料。因此，細(xì)胞毒性試驗(yàn)為生物學(xué)試驗(yàn)中首選試驗(yàn)項(xiàng)目。,（一）評價類型簡介,醫(yī)療器械的細(xì)胞毒性可以有以下二種評價類型：1. 按不同生物學(xué)終點(diǎn)評價 (1) 細(xì)胞形態(tài)學(xué)評價：定性檢測方法，結(jié)果評價相對比較初淺，通常僅作為一種輔助或補(bǔ)充的方法。 (2) 細(xì)胞膜效應(yīng)評價：中性紅染色法，臺盼蘭染色法，熒光素染色法等。

16、 (3) 細(xì)胞生長能力評價：細(xì)胞增殖度測定。 (4) 細(xì)胞代謝特性評價：ＭＴＴ法、各種測定細(xì)胞總蛋白量，蛋白質(zhì)合成率和酶活性的方法。,,2. 按不同接觸方式評價 (1) 浸提液方式：將供試品浸在介質(zhì)介質(zhì)中，經(jīng)過一定的時間和溫度的作用，取其浸提液與培養(yǎng)的細(xì)胞接觸。(2) 直接接觸方式：將供試品直接與培養(yǎng)的細(xì)胞接觸。(3) 間接接觸方式：將細(xì)胞與供試品隔開，在該體系中上層的供試品可以通過中間介質(zhì)中的孔隙影響下層的細(xì)胞。包括瓊

17、脂擴(kuò)散試驗(yàn)、濾膜擴(kuò)散試驗(yàn)。,常用的細(xì)胞毒性試驗(yàn),MTT （四唑鹽）法：哺乳動物細(xì)胞的線粒體酶可將黃綠色的MTT降解形成藍(lán)紫色的物質(zhì)，用二甲基亞砜（DMSO）將其溶解成溶液，用酶標(biāo)儀測定其濃度，從而定量測定細(xì)胞的存活比例。該試驗(yàn)用于細(xì)胞毒性定量評價。對該試驗(yàn)有干擾的供試品不適于本試驗(yàn)。,浸提方法,常用浸提方法舉例：按照4g/20ml浸提介質(zhì)的比例，浸提介質(zhì)為含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，（37±1）℃，（24±2）h。注意

18、：浸提液接觸細(xì)胞之前，如果進(jìn)行過濾、離心等處理，應(yīng)詳細(xì)記錄并對這些步驟加以說明。宜避免對浸提液進(jìn)行處理，例如對pH值的調(diào)整，因?yàn)檫@會影響到試驗(yàn)結(jié)果。,細(xì)胞毒性結(jié)果分析,定性評價：分級達(dá)到2級以上時被認(rèn)為有細(xì)胞毒性效應(yīng)。 定量評價： 細(xì)胞活性下降大于 30%被認(rèn)為有細(xì)胞毒性反應(yīng)。,細(xì)胞毒性結(jié)果評價,細(xì)胞毒性僅僅是一種最初的信號，它預(yù)示存在體內(nèi)毒性的可能性，事實(shí)上單憑細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)還未必能確定該器械一定不適用于特定的臨床應(yīng)用在對細(xì)胞毒性的

19、結(jié)果評價時需要結(jié)合其他生物相容性數(shù)據(jù)和產(chǎn)品的預(yù)期用途進(jìn)行綜合評價。在解釋試驗(yàn)數(shù)據(jù)時還必須考慮到該試驗(yàn)系統(tǒng)的局限性。,,刺激試驗(yàn),刺激是不涉及免疫學(xué)機(jī)制的一次、多次或持續(xù)與試驗(yàn)材料接觸所引起的局部炎癥反應(yīng)。要測定器械、材料及其潛在可溶出物的刺激作用，試驗(yàn)的進(jìn)行應(yīng)與使用或接觸的途徑和持續(xù)時間相適應(yīng)。刺激試驗(yàn)具有較高的敏感性，是醫(yī)療器械三項(xiàng)基本生物學(xué)評價項(xiàng)目之一。,刺激試驗(yàn)類型,皮膚刺激皮內(nèi)反應(yīng)特殊的刺激試驗(yàn)：眼、口腔、陰莖、直腸和

20、陰道刺激等,注：,任何顯示為皮膚刺激物或pH≤2.0或≥11.5的材料也不宜再進(jìn)行試驗(yàn)，宜標(biāo)示為潛在的眼刺激物。 任何已顯示為皮膚或眼的刺激物，或pH≤2.0或≥11.5的材料不應(yīng)再進(jìn)行試驗(yàn)，可標(biāo)示為潛在的口腔、陰莖、直腸、陰道組織組織刺激物。任何顯示為皮膚、眼、黏膜組織刺激物的材料，或是pH≤2.0或≥11.5的材料，不應(yīng)進(jìn)行皮內(nèi)試驗(yàn)。,皮 內(nèi) 反 應(yīng),試驗(yàn)結(jié)果評價,對一些廣泛應(yīng)用于人體正?；驌p傷皮膚的產(chǎn)品,一般不允許對皮膚有實(shí)

21、質(zhì)性危害存在。在某些情況下，陽性試驗(yàn)劑量不一定就判定材料不能使用。,致敏試驗(yàn),定義：免疫介導(dǎo)的對某種物質(zhì)的皮膚反應(yīng)。該試驗(yàn)屬體內(nèi)試驗(yàn)，方法學(xué)相對比較成熟，靈敏性較高，因此為各類醫(yī)療器械必須評價的項(xiàng)目之一。,方法,最大劑量法封閉斑貼法小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)（LLNA）,試驗(yàn)結(jié)果評價,按本標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)步驟得出的試驗(yàn)結(jié)果不能單獨(dú)成立。陰性試驗(yàn)結(jié)果往往不能排除產(chǎn)品可能導(dǎo)致皮膚過敏反應(yīng)的可能性。出現(xiàn)陽性試驗(yàn)結(jié)果有時不一定就表明器械或材料不能使

22、用。,全身毒性試驗(yàn),急性全身毒性　亞急性全身毒性　亞慢性全身毒性　慢性毒性　熱原反應(yīng),,重復(fù)接觸全身毒性試驗(yàn),定義,急性全身毒性：在24h內(nèi)一次、多次或持續(xù)接觸試驗(yàn)樣品后在任何時間發(fā)生的不良作用。注：與藥典上的異常毒性試驗(yàn)不同。亞急性全身毒性：在24h～28d內(nèi)多次或持續(xù)接觸試驗(yàn)樣品后發(fā)生的不良作用。亞慢性全身毒性：反復(fù)或持續(xù)接觸試驗(yàn)樣品后在動物壽命期的某一階段發(fā)生的不良作用。慢性全身毒性：在動物的主要壽命期內(nèi)反復(fù)或持續(xù)接

23、觸試驗(yàn)樣品后發(fā)生的不良作用。,重復(fù)接觸全身毒性試驗(yàn),,,接觸途徑接觸劑量接觸時間,接觸途徑,GB/T 16886.11-2011中規(guī)定，醫(yī)療器械或其可瀝濾物可通過多種接觸途徑進(jìn)入人體，亞慢性（亞急性）全身毒性試驗(yàn)最好采用具有臨床相關(guān)性的接觸途徑，如采用其他接觸途徑應(yīng)予以論證。接觸方式有皮膚、植入、吸入、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔、靜脈、經(jīng)口、皮下等。,接觸劑量,對于較長期試驗(yàn)，宜包括至少三種劑量水平和適當(dāng)?shù)膶φ战M。采用一種適宜的試驗(yàn)樣品劑

24、量進(jìn)行單劑量組試驗(yàn)可判定是否存在毒性危害（即限度試驗(yàn)），但其他多劑量或劑量反應(yīng)試驗(yàn)要求多個劑量組來判定毒性反應(yīng)。如準(zhǔn)備采用加嚴(yán)劑量，可增加劑量組。,,劑量頻率：應(yīng)具有臨床相關(guān)性。在重復(fù)接觸試驗(yàn)中，試驗(yàn)周期內(nèi)動物最好每周7日接觸試驗(yàn)樣品。劑量體積：GB/T 16886.11-2011中附錄B規(guī)定試驗(yàn)樣品接觸最大劑量體積，但不應(yīng)做為常規(guī)接觸劑量的選擇。,結(jié)果評價,觀察項(xiàng)目：體重變化、臨床觀察、臨床病理學(xué)、大體病理學(xué)、器官稱重、組織病理

25、學(xué)等。綜合分析各指標(biāo)，判定是否具有“生物學(xué)相關(guān)性”。應(yīng)注意此類試驗(yàn)的局限性，對結(jié)果進(jìn)行科學(xué)的判斷。,熱原試驗(yàn),致熱性是某種化學(xué)制劑或其他能產(chǎn)生發(fā)熱反應(yīng)物質(zhì)的一種特性。本部分所涉及的是材料介導(dǎo)的致熱性。常用方法是將材料浸提液由靜脈注入兔內(nèi)，在一定時間內(nèi)觀察兔體溫變化，以判斷在材料或浸提液中所含熱原量是否符合人體應(yīng)用要求。只做該項(xiàng)試驗(yàn)尚不能區(qū)分熱原反應(yīng)是因材料本身還是因內(nèi)毒素污染所致。只有同細(xì)菌內(nèi)毒性試驗(yàn)相結(jié)合才能做出熱原反應(yīng)是否是

26、因材料致熱性所致。,,內(nèi)毒素介導(dǎo)的致熱性這種致熱形式源自于革蘭氏陰性細(xì)菌的生物活性內(nèi)毒素，通常為醫(yī)療器械制造過程中的誘導(dǎo)發(fā)熱的污染物，可采用特異性細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)（鱟試劑法）測定器械內(nèi)毒素含量來進(jìn)行評價。材料介導(dǎo)的致熱性該類型致熱性為非內(nèi)毒素相關(guān)因素引起，,,一般認(rèn)為，熱原試驗(yàn)主要適用于與循環(huán)血液接觸的器械。ASTM規(guī)定，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胸腔接觸的器械也要進(jìn)行熱原試驗(yàn)。注：熱原試驗(yàn)是靜脈注射，需要考慮浸提液的狀態(tài)。,遺傳毒性,試

27、驗(yàn)?zāi)康模菏褂貌溉閯游锘蚍遣溉閯游锛?xì)胞培養(yǎng)或其他技術(shù)來測定由醫(yī)療器械、材料和(或)其浸提液引起的基因突變、染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變，以及其他DNA或基因毒性。,遺傳毒性,實(shí)驗(yàn)策略：優(yōu)先體外試驗(yàn)，方案1：細(xì)菌基因突變試驗(yàn)、哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)、哺乳動物細(xì)胞誘導(dǎo)性試驗(yàn).方案2：細(xì)菌基因突變試驗(yàn)、哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)（覆蓋誘裂性和基因突變）。,遺傳毒性,實(shí)驗(yàn)策略：如果體外試驗(yàn)出現(xiàn)陽性，應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)誘變性試驗(yàn)。常用體內(nèi)試驗(yàn)包括嚙齒動物微核試驗(yàn)

28、、嚙齒動物骨髓中期分析、哺乳動物肝細(xì)胞程序外DNA合成試驗(yàn)。,血液相容性,試驗(yàn)?zāi)康模貉合嗳菪栽囼?yàn)用一個相應(yīng)的模型或系統(tǒng)評價與血液接觸的醫(yī)療器械或材料對血液或血液成分的作用。,血液相容性,試驗(yàn)方法：血栓形成、凝血、血小板、血液學(xué)（溶血、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞活化、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)）、補(bǔ)體系統(tǒng),血液相容性,溶血試驗(yàn)： 供試品的溶血率應(yīng)小于5% 。 血,生殖毒性試驗(yàn),試驗(yàn)?zāi)康模涸u價試驗(yàn)樣品對生殖功能、胚胎發(fā)育（致畸性）以及胎兒和早期嬰兒發(fā)育潛在影

29、響。,生殖毒性試驗(yàn),可能需要進(jìn)行生殖及發(fā)育毒性試驗(yàn)的材料或器械： 1. 與生殖組織或胚胎（胎兒）直接長期或永久接觸的器械。 2. 儲能醫(yī)療器械。 3. 可吸收材料或可溶出物質(zhì)。（如在吸收、代謝和分布研究方面有充分可靠的數(shù)據(jù)，或者材料或醫(yī)療器械浸提液中鑒別出的所有成分均無生殖和發(fā)育毒性時，就無需進(jìn)行試驗(yàn)。,重點(diǎn)試驗(yàn),,60,內(nèi) 容,,,植入后局部反應(yīng)試驗(yàn),2,,細(xì)胞毒性的定義,根據(jù)歐洲標(biāo)準(zhǔn)化組織CEN1992年30號文件的定義,細(xì)胞毒性

30、是指由產(chǎn)品、材料及其浸提物所造成的細(xì)胞死亡、細(xì)胞溶解和細(xì)胞生長抑制。ISO10993.5-2009的定義： Cytotoxicity is an irreversible damage to living cells. 對活細(xì)胞不可逆的損害。,細(xì)胞毒性試驗(yàn)是運(yùn)用哺乳動物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，檢測醫(yī)療器械/材料引起的細(xì)胞生長抑制，溶解死亡等毒性作用。,體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)的特點(diǎn),對毒物高度敏感。試驗(yàn)周期短，可用于快速篩選。試驗(yàn)

31、方法標(biāo)準(zhǔn)化，試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，便于實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果比對。,體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)具有通用性, 廣泛適用于各種醫(yī)療器械和材料的評價。,ISO10993.5-2009,ISO 10993-5:2009和GB/T16886.5-2003(ISO 10993-5:1999)的區(qū)別,新標(biāo)準(zhǔn)修訂內(nèi)容如下：修改了“材料浸提液的制備”、“試驗(yàn)步驟”“結(jié)果評價”等相關(guān)內(nèi)容，給出了細(xì)胞毒性定性和定量評價指標(biāo)；—增加了“附錄A中性紅攝取(NRU)細(xì)胞毒性試驗(yàn)”

32、；— 增加了“附錄B 集落形成細(xì)胞毒性試驗(yàn)”；— 增加了“附錄C MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)”；— 增加了“附錄D XTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)”。,細(xì)胞毒性測定中所使用的大量終點(diǎn)測定方法可分成以下評價類型： — 按形態(tài)學(xué)方法評定細(xì)胞損傷； — 細(xì)胞損傷的測定； — 細(xì)胞生長的測定； — 細(xì)胞代謝特性的測定。,ISO10993-5:2009術(shù)語和定義,近匯合 subconfluency 在對

33、數(shù)生長期末，約80%的細(xì)胞融合。 空白 blank 不含試驗(yàn)樣品的浸提介質(zhì)，浸提期間置于與試驗(yàn)樣品相同的器皿中，并經(jīng)受與試驗(yàn)樣品相同的條件。,浸提液試驗(yàn),浸提液試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性穩(wěn)定。樣品與其他類似器械或材料的結(jié)果在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部和各實(shí)驗(yàn)室間的水平上具有可比性。 浸提液試驗(yàn)被普遍認(rèn)可。,a) 含血清培養(yǎng)基;b) 生理鹽水溶液;c) 其他適宜的介質(zhì)。

34、 含血清培養(yǎng)基是首選的浸提介質(zhì)，優(yōu)先選用含血清培養(yǎng)基用于浸提是由于其具有支持細(xì)胞生長以及浸提極性和非極性兩種物質(zhì)的能力。 除了含血清培養(yǎng)基，在明確要浸提極性物質(zhì)（例如離子化合物）時宜考慮采用無血清培養(yǎng)基。其他適宜的介質(zhì)包括水和二甲基亞砜（DMSO）。在所選擇的測試系統(tǒng)中, DMSO如高于0.5％（體積分?jǐn)?shù)）時有細(xì)胞毒性。與含血清培養(yǎng)基浸提法相比，由于DMSO浸提液稀釋度較大，溶出物的細(xì)胞接觸濃度會比較低。,浸提介

35、質(zhì),含血清培養(yǎng)基按照a) （37±1）℃規(guī)定的浸提條件，因?yàn)榻釡囟瘸^（37±1）℃會對血清化學(xué)和/或血清穩(wěn)定性以及培養(yǎng)基中其他成分產(chǎn)生不良影響。 浸提液接觸細(xì)胞之前，如果進(jìn)行過濾、離心或用其他方法處置，最終報告中對此應(yīng)詳細(xì)記錄并對這些步驟加以說明，對浸提液pH值的調(diào)整也應(yīng)在報告中說明。宜避免對浸提液進(jìn)行處理，例如對pH值的調(diào)整，因?yàn)檫@會影響到試驗(yàn)結(jié)果。,浸提條件,細(xì)胞系,優(yōu)先采用已建立的細(xì)胞系

36、并應(yīng)從認(rèn)可的貯源獲取。若貯存某一原種培養(yǎng)細(xì)胞系時, 則應(yīng)將其放在相應(yīng)培養(yǎng)基內(nèi), 在－80℃或－80℃以下凍存，培養(yǎng)基內(nèi)加有低溫防護(hù)劑, 如二甲基亞砜或甘油。長期貯存（數(shù)月至數(shù)年）只能在－130℃或－130℃以下凍存。,培養(yǎng)基,培養(yǎng)基應(yīng)無菌。含血清或無血清培養(yǎng)基應(yīng)符合選定細(xì)胞系的生長要求。培養(yǎng)基中可含有對試驗(yàn)無不良作用的抗生素。,原種培養(yǎng)細(xì)胞制備,用選定的細(xì)胞系和培養(yǎng)基制備試驗(yàn)所需的細(xì)胞。使用存儲細(xì)胞時, 如加有低溫防護(hù)劑要除去,

37、 使用前至少傳代培養(yǎng)一次。 傳代培養(yǎng)細(xì)胞時, 采用適合細(xì)胞系的酶分散法和/或機(jī)械分散法。,試驗(yàn)步驟,平行樣數(shù) 應(yīng)至少采用三個平行試驗(yàn)樣品數(shù)和對照品數(shù)。 浸提液試驗(yàn) 本試驗(yàn)用于細(xì)胞毒性定性和定量評定。試驗(yàn)宜在近匯合單層細(xì)胞或新鮮懸浮細(xì)胞上進(jìn)行。 試驗(yàn)開始前用顯微鏡驗(yàn)證培養(yǎng)細(xì)胞的近匯合和形態(tài)學(xué)情況。經(jīng)過至少24h的培養(yǎng)后，確定細(xì)胞毒性反應(yīng)。,細(xì)胞毒性的測定,可采用定性或定量方法測定細(xì)胞毒性反應(yīng)。

38、定性評價: 用顯微鏡檢查細(xì)胞，必要時采用細(xì)胞化學(xué)染色，評價諸如一般形態(tài)、空泡形成、脫落、 細(xì)胞溶解和胞膜完整性等方面的改變。在試驗(yàn)報告中應(yīng)描述性地或以數(shù)字記錄正常形態(tài)的變化，表1給出了用于對試驗(yàn)樣品分級的方法。,表1 浸提液細(xì)胞毒性形態(tài)學(xué)定性分級,正常開始,正常中間,正常結(jié)束,正常細(xì)胞,給毒后的細(xì)胞形態(tài)：,陰性對照,空白對照,陽性對照,四級結(jié)果,浸提液試驗(yàn)的定量評價,定量評價: 測定細(xì)胞死亡、細(xì)胞生長抑制、細(xì)胞增殖或克隆形成?？梢杂每陀^

39、的方法對細(xì)胞數(shù)量、蛋白總量、酶的釋放、活體染料的釋放、活體染料的還原或其他可測定的參數(shù)進(jìn)行定量測試。試驗(yàn)報告中應(yīng)記錄使用的方法和反應(yīng)。ISO10993-5：2009規(guī)定細(xì)胞活性下降大于 30%被認(rèn)為有細(xì)胞毒性反應(yīng)。,ISO10993-5 ：2009附錄C（資料性附錄） MTT 細(xì)胞毒性試驗(yàn),原理 通過細(xì)胞代謝活性測定細(xì)胞的存活率。 MTT黃色水溶液 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diph

40、enyltetrazoliumbromid)在活細(xì)胞內(nèi)代謝性減少，生成藍(lán)紫色不可溶的甲瓚。甲瓚溶于異丙醇后用分光光度計(jì)測定的色度與活細(xì)胞數(shù)目相關(guān)。,試驗(yàn)步驟,基本步驟 L929細(xì)胞接種至96孔板，維持培養(yǎng)24h（～1倍周期），至形成半?yún)R合單層。然后與系列濃度試驗(yàn)化合物接觸。接觸24h后測定每一試驗(yàn)濃度甲瓚形成，與對照培養(yǎng)細(xì)胞的甲瓚形成進(jìn)行比較。計(jì)算每一試驗(yàn)濃度生長抑制百分比。,材料,試驗(yàn)用細(xì)胞系采用L929細(xì)胞(NCTC clone

41、 929: CCL 1, American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, VA, USA; ECACC No. 88102702, European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK)，試驗(yàn)用細(xì)胞應(yīng)無支原體感染。,試驗(yàn)質(zhì)量檢查（Ⅰ）:陽性對照(PC)和陰性對照(NC),,試驗(yàn)質(zhì)量檢查（Ⅱ）：空白

42、,未經(jīng)處理空白的光密度（OD570）絕對值可表明，在試驗(yàn)的兩天內(nèi)以每孔1×104接種的細(xì)胞是否以正常的倍增時間以指數(shù)方式增長?？瞻譕D570平均值如≥0.2，則試驗(yàn)符合接受標(biāo)準(zhǔn)。為了檢查細(xì)胞接種系統(tǒng)誤差，將空白加到96孔板的左（第2列）、右（第11列）兩側(cè)。左、右兩列空白平均值與全部空白平均值相差如不大于15%，則試驗(yàn)符合接受標(biāo)準(zhǔn)。對于細(xì)胞接種誤差的檢查，也可以通過相差顯微鏡檢查每塊板，以確保細(xì)胞數(shù)量一致。采用顯微鏡評

43、價則可免除兩列空白的操作。,MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)操作流程,數(shù)據(jù)記錄,試驗(yàn)樣品（100%浸提液）組試驗(yàn)細(xì)胞存活率下降至如<空白組試驗(yàn)細(xì)胞存活率的70%，則具有潛在的細(xì)胞毒性。,ISO10993-5：2009附錄D（資料性附錄） XTT細(xì)胞毒性試驗(yàn),原理通過線粒體脫氫酶的測定反應(yīng)細(xì)胞的存活率。XTT (2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]

44、 -2H-tetrazolium hydroxide)與線粒體脫氫酶反應(yīng)，生成水溶性甲瓚。用分光光度計(jì)測定的色度與活細(xì)胞數(shù)目相關(guān)。,細(xì)胞系采用L929細(xì)胞(NCTC clone 929: CCL 1, American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, VA, USA; ECACC No. 88102702, European Collection of Cell Cultures,

45、Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK)，細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)無支原體。,試驗(yàn)質(zhì)量檢查（Ⅰ）:陽性對照(PC)和陰性對照(NC),每項(xiàng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)都包括陽性對照和陰性對照。,試驗(yàn)質(zhì)量檢查（Ⅱ）：空白,未經(jīng)處理空白的光密度（OD450）絕對值可表明，在試驗(yàn)的兩天內(nèi)以每孔1×104接種的細(xì)胞是否以正常的倍增時間以指數(shù)方式增長?？瞻譕D450平均值如≥0.2，則試驗(yàn)符合接受標(biāo)準(zhǔn)。為了檢查細(xì)胞接種系統(tǒng)誤差，將空白

46、加到96孔板的左（第2列）、右（第11列）兩側(cè).左、右兩列空白平均值與全部空白平均值相差如不大于15%，則試驗(yàn)符合接受標(biāo)準(zhǔn)。對于細(xì)胞接種誤差的檢查，也可以通過相差顯微鏡檢查每塊板，以確保細(xì)胞數(shù)量一致。采用顯微鏡評價則可免除兩列空白的操作。,XTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)操作流程,數(shù)據(jù)分析,活細(xì)胞數(shù)減少是由于樣品中線粒體脫氫酶總活性降低，這直接與生成的橙色甲瓚量有關(guān)，在450nm測量光密度。與空白比較計(jì)算存活率下降情況。,數(shù)據(jù)記錄,試驗(yàn)樣品（10

47、0%浸提液）組試驗(yàn)細(xì)胞存活率下降至如<空白組試驗(yàn)細(xì)胞存活率的70%，則具有潛在的細(xì)胞毒性。,ISO10993.5-2009附錄A（資料性附錄）中性紅攝取(NRU)細(xì)胞毒性試驗(yàn),概述將BALB/c 3T3細(xì)胞接種至96孔平板內(nèi)并維持培養(yǎng)24h（～1倍周期），至形成半?yún)R合單層。然后與系列濃度的試驗(yàn)混合物接觸，24h后測定每一試驗(yàn)濃度的NRU并與對照培養(yǎng)細(xì)胞測定進(jìn)行比較。,BALB/c 3T3細(xì)胞、clone 31（如ECACC86

48、110401，European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK；CCL-163，American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, VA, USA) 和從CCL-163[ATCC]制備的JCRB 9005（Human Science Research Resources Bank, Osaka,

49、Japan）。,細(xì)胞系,試驗(yàn)質(zhì)量檢查（Ⅰ）:陽性對照(PC),細(xì)胞毒性試驗(yàn)應(yīng)包括陽性對照。多數(shù)化學(xué)物有歷史資料或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)、實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)試驗(yàn)的支持，十二烷基硫酸鈉（SLS,CAS # 151-21-3）即是最經(jīng)常用于試驗(yàn)的一種化學(xué)物，因此推薦作為陽性對照。在使用SLS時推薦四個濃度標(biāo)度：0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL。SLS的IC50歷史平均值(Spielmann et. al., 1991

50、 [10])為0.093mg/mL。95%置信區(qū)間為0.070mg/mL至0.116mg/mLSLS的IC50如在95%置信區(qū)間，則試驗(yàn)符合標(biāo)準(zhǔn)。推薦使用陽性參照材料和陰性參照材料,試驗(yàn)質(zhì)量檢查（Ⅱ）：空白,未經(jīng)處理空白的光密度（OD540）絕對值可表明，在試驗(yàn)的兩天內(nèi)以每孔1×104接種的細(xì)胞是否以正常的倍增時間以指數(shù)方式增長。空白OD540平均值如≥0.3，則試驗(yàn)符合接受標(biāo)準(zhǔn)。為了檢查細(xì)胞接種系統(tǒng)誤差，將空白加到

51、96孔板的左（第2列）、右（第11列）兩側(cè)。左、右兩列空白平均值與全部空白平均值相差如不大于15%，則試驗(yàn)符合接受標(biāo)準(zhǔn)。對于細(xì)胞接種誤差的檢查，也可以通過相差顯微鏡檢查每塊板，以確保細(xì)胞數(shù)量一致。采用顯微鏡評價則可免除兩列空白的操作。,試驗(yàn)質(zhì)量檢查（Ⅲ）：濃度-反應(yīng)質(zhì)量檢查,由濃度-反應(yīng)得出的IC50宜至少有兩個或三個（NRU抑制率在10%和90%之間的反應(yīng)作為支撐。否則，濃度稀釋因子可能易于降低，放棄該試驗(yàn)并采用較小的稀釋因子重復(fù)

52、試驗(yàn)。,3T3NRU細(xì)胞毒性試驗(yàn)操作流程,樣品浸提液最高濃度（100%浸提液）的細(xì)胞相對活性如≥對照組的70%，材料應(yīng)被認(rèn)為無細(xì)胞毒性。浸提液如顯示細(xì)胞毒性反應(yīng)，計(jì)算每一試驗(yàn)濃度（即試驗(yàn)化學(xué)物濃度）的生長抑制率。從濃度反應(yīng)計(jì)算IC50（即產(chǎn)生50%NRU還原的濃度），以浸提液稀釋百分比表示。浸提原液為100%浸提液。,數(shù)據(jù)分析,ISO10993-5：2009附錄B（資料性附錄）集落形成細(xì)胞毒性試驗(yàn),試驗(yàn)概述將V79細(xì)胞加到6孔板中

53、，保持培養(yǎng)24h至開始對數(shù)生長階段。然后與系列濃度的試驗(yàn)物接觸，孵育6天，于集落較大時計(jì)數(shù)。用甲醇固定集落，吉姆薩液染色并計(jì)數(shù)。,細(xì)胞系,V79細(xì)胞（JCRB 0603, Human Science Research Resources Bank, Osaka, Japan；或美國和歐洲細(xì)胞庫的其他細(xì)胞）注：推薦使用V79細(xì)胞，因?yàn)槠淠苄纬纱蟛⑶逦募洹?試驗(yàn)質(zhì)量檢查（Ⅰ）:陽性對照(PC)陰性材料 (NC),細(xì)胞毒性試驗(yàn)應(yīng)包括陽性

54、對照和陰性對照。如ZDEC和ZDBC。ZDEC的IC50宜不超過7%。ZDBC的IC50宜不超過80%。,試驗(yàn)質(zhì)量檢查（Ⅱ）：空白,空白集落平均數(shù)如至少為細(xì)胞板每孔細(xì)胞數(shù)目的70%，則試驗(yàn)符合接受標(biāo)準(zhǔn)。,試驗(yàn)質(zhì)量檢查（Ⅲ）：濃度-反應(yīng)質(zhì)量檢查,由濃度-反應(yīng)得出的IC50宜至少有兩個或三個對照抑制率在10%和90%之間的反應(yīng)作為支撐。否則，濃度稀釋因子可能易于降低，放棄該試驗(yàn)并采用較小的稀釋因子重復(fù)試驗(yàn)。,試驗(yàn)步驟,注意：原種細(xì)胞解

55、凍后，細(xì)胞在用于試驗(yàn)之前要傳代2～3次。第1天 用MEM05培養(yǎng)基制備33.3個細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液。6孔板的每孔加入3mL細(xì)胞懸液。第2天 孵育24h后從每孔中吸出培養(yǎng)基。加入2mL用MEM05培養(yǎng)基制備的100%浸提液或稀釋浸提液。每一濃度平行制備3孔。置培養(yǎng)箱再孵育6天。第8天 從每孔中吸出培養(yǎng)基，用PBS沖洗每一孔，加入甲醇固定集落，再用5%吉姆薩液染色。計(jì)算每一孔集落數(shù)目。,結(jié)果表示,集落形成細(xì)胞毒性試

56、驗(yàn)平板效率如≥對照組的70%，材料應(yīng)被認(rèn)為無細(xì)胞毒性。浸提液如對細(xì)胞顯示細(xì)胞毒性作用，計(jì)算IC50(濃度抑制率至50%)，以浸提液百分比表示。注：平板效率：對照組集落數(shù)目除以浸提液組集落數(shù)目，以百分?jǐn)?shù)表示系數(shù)。,直接接觸試驗(yàn),本試驗(yàn)用于細(xì)胞毒性定性和定量評價。 在每只器皿中央部位的細(xì)胞層上各小心地放置一個試驗(yàn)樣品的試樣, 確保試樣覆蓋細(xì)胞層表面約十分之一。 適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)周期（最少24h ）。按表2確定細(xì)胞毒性反應(yīng)。,間接接觸試驗(yàn)

57、-瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),本試驗(yàn)用于細(xì)胞毒性定性評價。不適用于不能通過瓊脂層擴(kuò)散或可能與瓊脂相互作用的可瀝濾物。 將試驗(yàn)樣品的試樣小心地放在每只器皿的固化瓊脂層上, 確保試樣覆蓋細(xì)胞層表面約十分之一。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)周期（培養(yǎng)24h～72h）。按表2確定細(xì)胞毒性反應(yīng)。,間接接觸試驗(yàn)-濾膜擴(kuò)散試驗(yàn),本試驗(yàn)用于細(xì)胞毒性定性評價?？讖?.45μm、無表面活性劑的濾膜 。 將試驗(yàn)樣品的試樣小心地放到濾膜無細(xì)胞面的上面。濾膜上放置不產(chǎn)生反應(yīng)的環(huán), 用

58、以保留浸提液和新加入的混合物。 適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)周期（培養(yǎng)2h±10min ）。按表2確定細(xì)胞毒性反應(yīng)。,表2瓊脂和濾膜擴(kuò)散試驗(yàn)及直接接觸試驗(yàn)反應(yīng)分級,植入后局部反應(yīng)試驗(yàn),ISO 10993-6:2007和GB/T16886.6-1997（ISO 10993-6:1994）的區(qū)別： 新標(biāo)準(zhǔn)修訂內(nèi)容如下：修改了“范圍”， 適用范圍增加可降解和/或可吸收性材料；修改了“植入試驗(yàn)方法通則”、“評價和試驗(yàn)報告”、“肌肉植入中

59、植入樣品的數(shù)量”等相關(guān)內(nèi)容；增加了“試驗(yàn)方法的基本方面”；增加了“附錄A 可降解/可吸收性材料植入周期和組織反應(yīng)的基本考慮”；增加了“附錄E 植入后局部生物學(xué)反應(yīng)評價舉例”。,概述,植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)是把醫(yī)療器械材料植入實(shí)驗(yàn)動物肌肉，皮下組織，骨組織中，在一定周期后，通過肉眼觀察和顯微技術(shù)評價植入部位和周圍組織反應(yīng)情況，樣品對活體組織的局部毒性作用。,可能需要進(jìn)行植入試驗(yàn)的樣品,（一）組織反應(yīng)的基本過程,1 炎癥期：以炎癥細(xì)胞滲出

60、和浸潤為主，（1）早期主要以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主；（2）后期出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞（巨噬細(xì)胞）、漿細(xì)胞為主的反應(yīng)--細(xì)胞成分可因材料的不同而不同。一般2-4周炎癥反應(yīng)最強(qiáng)，以后逐漸減弱，3個月后炎癥反應(yīng)應(yīng)基本消失。例如：纖維蛋白膠：漿細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞；膠原蛋白材料：淋巴細(xì)胞和異物細(xì)胞；,,2 纖維組織化期： 在炎癥期的炎癥反應(yīng)外側(cè)出現(xiàn)纖維母細(xì)胞為主的肉芽組織，隨著炎癥反應(yīng)的消退，以及纖維細(xì)胞增生和分泌膠原纖維

61、，纖維細(xì)胞逐漸減少，最終被纖維組織形成的包囊包裹。,（二）植入部位,試驗(yàn)樣品應(yīng)植入與材料臨床應(yīng)用最相關(guān)的組織 ：1）肌肉植入2）皮下植入3）骨植入4）特殊部位植入,植入方式,肌肉植入皮下組織植入骨植入,肌肉植入,皮下植入,骨植入,肌肉植入試驗(yàn),把一定大小形狀的試驗(yàn)樣品植入實(shí)驗(yàn)動物的肌肉組織，同樣植入標(biāo)準(zhǔn)對照材料，對照材料是 已確立臨床可接收性和生物相容性良好的同類樣品材料。定期采集標(biāo)本和周圍組織，肉眼和顯微鏡下比較觀察試驗(yàn)樣

62、品和對照材料引起的組織生物學(xué)反應(yīng)。,皮下組織植入試驗(yàn),用于評定皮下組織對植入材料的生物學(xué)反應(yīng)。對試驗(yàn)樣品植入物與對照樣品植入物的生物學(xué)反應(yīng)進(jìn)行比較，對照材料是已確立臨床可接受性和生物相容性的醫(yī)療器械所采用的材料。,骨植入試驗(yàn),把植入物插入實(shí)驗(yàn)動物的骨組織內(nèi)，對試驗(yàn)樣品植入物與對照樣品植入物的生物學(xué)反應(yīng)進(jìn)行比較，對照材料是 已確立臨床可接收性和生物相容性良好的同類樣品材料。,實(shí)驗(yàn)動物,實(shí)驗(yàn)用兔被普遍選用。對于短期試驗(yàn)，通常使用嚙齒動物或

63、家兔。對于長期試驗(yàn)，嚙齒動物、家兔、犬、綿羊、山羊、豬及其他平均壽命相對較長的動物比較適宜。,（三）樣品制備,應(yīng)根據(jù)最終產(chǎn)品預(yù)期所用方法對每個植入樣品進(jìn)行制造、處理、污染物的清洗和滅菌，并應(yīng)在研究文件中進(jìn)行確認(rèn)。,皮下植入樣品制備,樣品狀態(tài)a) 薄片材料應(yīng)制成直徑10mm～12mm、厚度0.3mm～1.0mm的試驗(yàn)樣品。b) 塊狀材料應(yīng)制成直徑1.5mm、長5mm、兩端為圓頭的試驗(yàn)樣品。c) 非固體試驗(yàn)樣品（包括粉劑）應(yīng)裝入直徑1

64、.5mm、長5mm的導(dǎo)管內(nèi)。樣品數(shù)量：每種材料和每一植入期至少采用3只動物和足夠的植入部位，總數(shù)達(dá)到10個試驗(yàn)樣品和10個對照樣品。,肌肉植入樣品制備,樣品狀態(tài)： 寬1mm～3mm、長度約10mm 較大樣品：直徑10mm、厚度3mm 樣品應(yīng)制成圓形邊緣，兩端拋光至純圓半徑。樣品數(shù)量： 每一植入期至少采用3只動物和足夠的植入部位，總數(shù)達(dá)到10個試驗(yàn)樣品和10個對照樣品。,骨植入樣品制備,樣品狀態(tài)：家兔：直徑2mm、

65、長6mm的圓柱體樣品數(shù)量：每一植入期應(yīng)評價至少10個試驗(yàn)樣品和10個對照樣品。,（四）試驗(yàn)周期,試驗(yàn)周期應(yīng)根據(jù)臨床可能接觸時間來確定，或是持續(xù)至相應(yīng)生物學(xué)反應(yīng)達(dá)到或超過某一穩(wěn)定狀態(tài)。選擇的時間點(diǎn)應(yīng)進(jìn)行說明和論證。非降解、非吸收性材料：1）短期反應(yīng)：1周到4周；2）長期反應(yīng)：12周以上。,結(jié)論,結(jié)論：在本試驗(yàn)下列情況下，試驗(yàn)樣品判定為：—無刺激（0.0～2.9）—輕微刺激（3.0～8.9）—中度刺激（9.0～15.0）—

66、重度刺激（>15）與陰性對照樣品比較組織反應(yīng)。,生物降解試驗(yàn),參考標(biāo)準(zhǔn)：GB/T16886.6試驗(yàn)周期應(yīng)與植入部位、植入物的尺寸、估計(jì)的降解時間相關(guān)。,可降解/可吸收性材料植入周期和組織反應(yīng)的基本考慮,應(yīng)對植入物各時間點(diǎn)與降解過程相關(guān)的局部組織反應(yīng)進(jìn)行評價（不推薦單一的植入時間點(diǎn)）：a)發(fā)生降解時；b)中期降解階段；c)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時，組織恢復(fù)或接近完全降解（一般需要達(dá)到或超過吸收終點(diǎn)，即完成預(yù)期的重塑和修復(fù)的最終組織

67、反應(yīng)或生物反應(yīng)恢復(fù)至正常組織學(xué)）。,刺激與皮膚致敏試驗(yàn),,ISO 10993-10:2010和GB/T16886.10-2005(ISO 10993-10:2002)的區(qū)別,新標(biāo)準(zhǔn)修訂內(nèi)容如下：修改了標(biāo)準(zhǔn)名稱；修改了術(shù)語和定義；取消了原“5.4材料鑒別”；皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn)由附錄B調(diào)整到正文中；人體皮膚刺激試驗(yàn)方法由正文調(diào)整到附錄C；皮膚致敏試驗(yàn)增加小鼠局部淋巴結(jié)檢驗(yàn)法；增加了附錄D體外皮膚刺激試驗(yàn)；增加了附錄E聚合物試驗(yàn)材料

68、浸提液制備方法。,皮膚致敏試驗(yàn),,概念,皮膚致敏 skin sensitization變應(yīng)性接觸性皮炎。免疫介導(dǎo)的對某種物質(zhì)的皮膚反應(yīng)。是一種免疫應(yīng)答反應(yīng)。,目前三種測定化學(xué)物潛在皮膚致敏性的動物試驗(yàn),最大劑量致敏試驗(yàn)(GPMT)封閉式貼敷試驗(yàn)(Buehler試驗(yàn))小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)（LLNA）,,皮膚致敏試驗(yàn),GPMT,BT,LLNA,皮膚評分,,,,,致敏性評價,,BrDU,淋巴細(xì)胞分析,,,,皮膚致敏試驗(yàn),豚鼠最大