生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 質(zhì)粒dna的提取

1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)8質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取（的提?。▔A裂解法堿裂解法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈮A裂解法提取質(zhì)粒的基本原理和主要應(yīng)用，掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)方法和各種試劑在提取過(guò)程中的作用。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理堿裂解法是利用細(xì)菌染色體DNA與質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)的大小差異來(lái)分離質(zhì)粒DNA的。堿性（pH12.0~12.5）條件可以破壞堿基配對(duì)，宿主和質(zhì)粒DNA的堿基之間的氫鍵被破壞。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)（加入酸性試劑中和），共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA會(huì)

2、迅速準(zhǔn)確地恢復(fù)配對(duì)，重新形成完全天然的超螺旋分子；而較大的細(xì)菌染色體DNA分子則難以復(fù)性，會(huì)交聯(lián)形成不溶于水的線(xiàn)團(tuán)結(jié)構(gòu)，纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上，離心時(shí)易被沉淀下來(lái)，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中，用異丙醇沉淀、70%乙醇洗滌即可獲得質(zhì)粒DNA。三、儀器設(shè)備三、儀器設(shè)備微量取液器（2μL；20μL；200μL；1000μL），tip頭，手掌型離心機(jī)，1.5mL離心管恒溫水浴，制冰機(jī)，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱。振蕩器，離心機(jī)，金屬浴，電泳儀，凝膠

3、成像儀。四、實(shí)驗(yàn)試劑四、實(shí)驗(yàn)試劑（1）溶液Ⅰ：50mmolL葡萄糖；20mmolLTrisHCl（pH=8.0）；10mmolLEDTA（pH=8.0），高壓蒸汽滅菌（121℃，0.105Mpa）20min。4℃貯存。（2）溶液Ⅱ（現(xiàn)用現(xiàn)配）：0.2molLNaOH；1gLSDS。（3）溶液Ⅲ（pH4.8）：每100mL溶液中含5molL乙酸鉀60mL；冰乙酸11.5mL；H2O28.5mL。（4）RNase（10mgmL），LB液體培

4、養(yǎng)基，氨芐青霉素，異丙醇，70%（VV）乙醇，無(wú)菌水。五、五、實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法（1）分裝3mLLB液體培養(yǎng)基和3μL氨芐青霉素（50mgmL）于15mL玻璃試管中。（2）用滅菌牙簽挑取一白色單克隆，放入玻璃管內(nèi)，置37℃恒溫?fù)u床中以200轉(zhuǎn)min培養(yǎng)，至OD600=2.0。（3）取菌液1.0mL于1.5mL的Eppendf管中，將離心管放入冷凍離心機(jī)，調(diào)溫至4℃，轉(zhuǎn)速3500g，離心5min，收集細(xì)菌。棄上清，倒置于吸水紙上，瀝干殘液。

5、（4）每離心管中加入冰上預(yù)冷的溶液Ⅰ200L，置振蕩器上劇烈震蕩，懸浮菌體。（5）加入新配制的溶液Ⅱ400L，翻轉(zhuǎn)10次。冰上放置。（6）冰浴3min內(nèi)迅速加入300L溶液Ⅲ，溫和翻轉(zhuǎn)10次，冰浴10min。超螺旋DNA比線(xiàn)性的DNA遷移率大，線(xiàn)性DNA比開(kāi)環(huán)DNA遷移率大。八、作業(yè)八、作業(yè)（1）按要求認(rèn)真撰寫(xiě)報(bào)告，包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)用品及藥品、實(shí)驗(yàn)步驟等，要詳細(xì)闡述質(zhì)粒提取的基本原理。（2）提取質(zhì)粒DNA過(guò)程中應(yīng)該注意的問(wèn)題