血小板去唾液酸化：膿毒癥血小板減少的一種新型發(fā)病機制和治療目標.pdf

1、目的：
　　本研究旨在明確血小板去唾液酸化與膿毒癥血小板減少發(fā)病的關系，從而詮釋膿毒癥血小板減少癥的一種可能的發(fā)病機制，同時評價唾液酸酶抑制劑奧司他韋在嚴重膿毒癥血小板減少癥患者促進或改善血小板生長的重大作用，為膿毒癥血小板減少癥的治療提供新的治療目標和對策。
　　方法：
　　1.研究對象的選擇:采用前瞻性、隨機、多中心、臨床對照研究(RCT)方法，選擇201405月到2016-2月入住山東齊魯醫(yī)院、煙臺毓璜頂醫(yī)院、煙

2、臺傳染病醫(yī)院和煙臺山醫(yī)院的來自ICU、呼吸科、血液科、傳染病科的感染伴或者不伴有血小板減少的膿毒癥患者，包括嚴重膿毒癥和膿毒癥休克患者。
　　2.研究分組:研究Ⅰ選取健康成年人為陰性對照組;隨機選取入住年齡在18到80歲的膿毒癥患者，根據感染后伴或不伴血小板減少分為:(1)膿毒癥血小板減少組;(2)膿毒癥血小板正常組。研究Ⅱ選取嚴重膿毒癥伴血小板減少(PLT≤50×109/L)患者，根據電腦隨機序列號，隨機分為;(1)奇數號:奧司

3、他韋應用組;(2)偶數號:對照組。
　　3.入選標準:膿毒癥、嚴重膿毒癥和膿毒癥休克患者診斷標準:根據2012年國際嚴重膿毒癥和膿毒癥休克診療指南的診斷標準。簡單說，膿毒癥是由明確或疑似感染加上至少兩個下列條件:體溫高于38.3℃或低于36℃，心率超過90次/分，呼吸急促，精神狀態(tài)改變，白細胞(WBC)計數大于12×109/L或小于4×109/L或升高的血漿原降鈣素(PCT)的水平。嚴重膿毒癥定義為膿毒癥+器官功能障礙。膿毒性休克

4、被定義為膿毒癥+低血壓（液體復蘇難以糾正的低血壓）或高乳酸血癥。血小板減少癥診斷標準:細菌、病毒、真菌等感染致病菌導致血小板減少，血小板計數小于100×109/L。
　　4.排除標準:假性血小板減少（血標本凝固，或者EDTA依賴的血小板抗體是否存在）;年齡小于18歲或者大于85歲;入院小于24小時;心肺復蘇術后患者;懷孕和哺乳期患者;惡性腫瘤或血液病患者;有骨髓、肝、腎、小腸移植史患者;6個月內接受或正在接受免疫抑制劑和激素治療患

5、者;終末期肝或腎功能衰竭者;測試前輸注血小板患者;藥物相關性血小板減少患者，如抗生素、肝素、低分子肝素、Ⅱ b/Ⅲa受體阻滯劑、ADP—受體拮抗劑、急性酒精中毒等。
　　5.研究終點:主要觀察結果為血小板去唾液酸化水平、血小板整體反應率和全因28天死亡率。次要結果包括血小板恢復時間、血小板輸注量。血小板整體反應率被定義為入組后血小板計數恢復至正常水平以上(100×109/L)的人數占入組總人數百分比。血小板恢復時間計算為患者入組到

6、血小板計數＞100×109/L的時間間隔。
　　6.數據收集:入組患者記錄以下數據:1）患者年齡、性別、疾病、既往病史、住院號、入住ICU原因。2）入住重癥患者24h序貫器官衰竭評分(SOFA)和急性生理學與慢性健康狀況評分系統(tǒng)(APACHEⅡ)及預后死亡率、住ICU時間、住院時間、ICU死亡率及全因28天死亡率。3）血小板去唾液酸化水平。4）入組時實驗室數據包括血液和化學測試，凝血化驗和動脈血氣分析。5)明確感染致病菌的各種檢驗

7、，如病毒相關抗體檢測、G實驗、GM實驗，及各種臨床標本的細菌培養(yǎng)，如痰、肺泡灌洗液、血、尿、引流液、分泌物等。6）干預治療，如機械通氣和持續(xù)腎臟替代治療(CRRT)。7)各種并發(fā)癥出現，如膿毒癥休克、急性呼吸衰竭綜合征、出血和血栓等事件。8）血小板輸注數量。各種實驗室數據采集限定在膿毒癥發(fā)病的24小時內。
　　7.奧司他韋的應用:研究Ⅱ兩組患者治療上均根據2012拯救嚴重膿毒癥和膿毒癥休克的診治原則，予以抗感染、液體復蘇、血管活性

8、藥物等相關治療。奧司他韋治療組:應用足量抗生素基礎上，入組24小時內開始給予奧司他韋75mg q12h口服5天;對照組:只應用足量抗生素，兩組患者均每日檢測血小板的計數，直到血小板升至100×109以上。不良反應記錄:重點記錄發(fā)熱、皮疹、惡心、嘔吐、肝功能不良反應及血栓形成等不良反應。
　　8.血小板制備:抽取受試者外周靜脈血2ml放入真空抗凝（EDTA或者肝素抗凝）管中，離心得富含血小板血漿，取20-50ul加入流式管中離心，得

9、血小板沉淀。同時檢測血常規(guī)明確血小板計數。
　　9.去唾液酸化檢測:流式細胞術檢測血小板表面去唾液酸化后暴露的β Gals的水平，即以PE-Cy5-CD41a單克隆抗體標記血小板，并同時標以FITC-RCA-Ⅰ，FITC-ECL，FITC-sWGA，測定記錄RCA-Ⅰ、ECL、sWGA的熒光百分比用來反映血小板去唾液酸化水平。
　　結果：
　　1.整個研究中，276名患者被觀察，261例符合入組標準。其中134個是膿毒

10、癥不伴有血小板減少癥患者，127人為膿毒癥伴血小板減少癥患者。而127例膿毒癥不伴有血小板減少癥患者中，110名為嚴重膿毒癥患者同時血小板計數小于50×109/L參與研究Ⅱ。隨機化后僅52例患者使用抗生素治療（對照組），而其他54患者使用抗生素治療+奧司他韋（奧司他韋組）。28天隨訪完成率為96.4％。
　　2.膿毒癥血小板減少患者比沒有血小板減少癥的患者有較高的SOFA評分[10(5，12)和5(3.25，7)，P＜0.001)

11、、PCT水平[6.69(1.0，38.9)和1.0(0.32，5.36)，P＜0.001)和肌酐水平[88(63.3，225)μmol/L和225(56，119.0)μmol/L，P=0.036)，但有較低的平均動脈壓(79.6±14.7 vs86.8±15.5mmHg，P＜0.001)。膿毒癥血小板減少癥患者比沒有血小板減少癥的有較高的腎臟替代(25.2％比14.2％，P=0.029)和膿毒性休克(18.9％比8.2％，P=0.017

12、)發(fā)生率。28天死亡率高膿毒癥血小板減少癥患者和無血小板減少癥的患者比(分別為36.2％和14.2％，P＜0.001)。
　　3.影響28天死亡率的危險因素分析結果表明血小板計數與28天死亡率呈負相關(OR=0.963,95％ CI:0.930-0.997,P=0.033)
　　4.研究表明，血流感染、大腸桿菌和新布尼亞病毒感染是膿毒癥患者易發(fā)生血小板減少癥的危險因素。相比之下，肺部感染和銅綠假單胞菌綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌

13、引起的膿毒癥，血小板減少癥的發(fā)生率相對少。
　　5.數據表明，膿毒癥伴血小板減少癥患者其血小板去唾液酸化水平較不伴有血小板減少癥患者明顯增高，正如檢測凝集素對比ECL(5.70±4.37％ vs2.33±1.90％;P＜0.001)，RCA-Ⅰ(95.64±4.19％ vs90.14±8.88％;P＜0.05)or sWGA(0.50±0.293％ vs0.15±0.95％;P＜0.001)。
　　6.奧司他韋治療治療后兩組

14、的反應和結果提示，隨機化治療后15天內血小板反應率在奧司他韋組是45對54例(83.3％)相比，對照組是34對52例對照組(65.4％，P=0.045)。血小板恢復時間對比奧司他韋組5(4，6)天，對照組7(5，10)天(P＜0.01)。血小板輸血量奧司他韋組(0.676±1.36單位)較對照組(1.35±1.98單位; P=0.044)明顯減少。
　　7.奧司他韋治療后兩組血小板計數隨著時間變化對比。最初，血小板計數分別為奧司他

15、韋組41.81±10.29×109/L和對照組46.69±9.13×109/L，兩組之間無顯著差異(P=0.560)。兩組血小板計數隨著時間不斷增加，第四天奧司他韋組達到91.30±21.51×109/L、對照組達到58.17±32.99×109/L，P=0.031，有統(tǒng)計學差異。從第四天到九天，兩組之間有顯著差別，其中第7、8、9天差異十分顯著，第十天血小板計數分別為奧司他韋組198.8±82.6×109/L，對照組147.7±81.

16、78×109/L，P=0.684，自第十天后兩組血小板計數統(tǒng)計學無差異。
　　8.多變量Cox比例風險模型被用來評估各個變量與奧司他韋治療的影響，其中SOFA、血小板生長有效時間、機械通氣、CVVH的P值均＜0.05，有統(tǒng)計學意義，提示以上因素均影響奧司他韋治療的成功率。
　　結論：
　　1.膿毒癥血小板減少患者血小板表面去唾液酸化水平明顯高于不伴有血小板減少患者，表明血小板去唾液酸化很可能參與了膿毒癥血小板減少的發(fā)病