血小板膜糖蛋白去唾液酸化效應(yīng)與ITP一線治療療效關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景：
　　原發(fā)免疫性血小板減少癥（ITP）是一種臨床常見(jiàn)的出血性疾病，目前對(duì)難治性ITP的發(fā)病機(jī)制尚未明確，且無(wú)有效的治療方法。ITP雖不是血液系統(tǒng)惡性疾病，但對(duì)于反復(fù)出現(xiàn)血小板重度減低，療效不佳的患者來(lái)說(shuō)，生存質(zhì)量極差，而且死亡風(fēng)險(xiǎn)也是極大的。ITP病理生理機(jī)制是多方面的，至今仍未完全明晰，目前得到公認(rèn)的是，絕大多數(shù)的 ITP的產(chǎn)生都是由體液免疫和細(xì)胞免疫共同介導(dǎo)的血小板破壞。ITP的一線治療藥物有糖皮質(zhì)激素和靜脈注射免疫

2、球蛋白（IVIG），其產(chǎn)生治療作用的主要機(jī)理包括抑制自身抗體的產(chǎn)生，封閉Fc受體的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)巨核細(xì)胞產(chǎn)生血小板等，最終達(dá)到提升患者的血小板計(jì)數(shù)水平。近年不同的研究組均發(fā)現(xiàn)，對(duì)于抗GPIIb/IIIa抗體介導(dǎo)的ITP，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和IVIG的一線治療效果尚可，但是，若患者體內(nèi)存在抗GPIb-V-IX復(fù)合物抗體，治療上給予上述一線治療效果往往較差。在目前較為明確的血小板清除的Fc受體依賴途徑外，是否存在其他

3、的途徑導(dǎo)致血小板的清除呢？最新的體外及體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究確認(rèn)了是存在非 FcR依賴的血小板清除途徑的。血小板膜上的糖蛋白在神經(jīng)氨酸酶作用下去唾液酸化而暴露乙酰葡糖胺及半乳糖等殘基，這些去唾液酸化后的血小板通過(guò)表面血管性血友病因子（VWF）受體復(fù)合物的聚集，改變了信號(hào)傳導(dǎo)，并結(jié)合到肝臟枯否氏細(xì)胞的MAC-1受體或肝細(xì)胞的去唾液酸糖蛋白受體（Ashwell-Morell受體），在肝臟枯否細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)清除，這不同于以往的血小板在脾臟清除的過(guò)程。

4、然而在 ITP患者體內(nèi)血小板的變化如何，是否也存在這種非Fc受體依賴的血小板清除途徑，導(dǎo)致一部分ITP患者應(yīng)用常規(guī)的一線治療效果不佳，目前尚未得到證實(shí)。
　　研究目的：
　　本課題旨在研究：（1）比較ITP患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化標(biāo)記物雞冠刺桐凝集素（ECL)、蓖麻凝集素（RCA-1）的結(jié)合水平與正常人的差異，分析ITP患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化的狀況；（2）血小板膜表面膜表面糖蛋白去唾液酸化效應(yīng)與ITP一線治

5、療療效關(guān)系，間接為血小板清除的非Fc受體依賴途徑的存在提供依據(jù)，以利于進(jìn)一步探索有效的治療方法；（3）研究抗GPIbα抗體與ITP患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化相關(guān)性；（4）ITP與其他疾病對(duì)照組的血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化水平的比較，探討在不同疾病中，去唾液酸化致血小板減少的發(fā)病機(jī)制存在的可能性。
　　研究方法：
　　1.自2013年3月至2015年1月收集安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院ITP患者作為研究對(duì)象，并以伴血小

6、板減少的初診風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、骨髓增生異常綜合征（MDS）、再生障礙性貧血（AA）和急性髓系白血?。ˋML）患者作為其他疾病對(duì)照組，安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢中心20例健康成年人作為正常對(duì)照組。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析
　　我們通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板表面ECL及RCA-1標(biāo)記的情況確定其膜表面糖蛋白去唾液酸化水平，ITP患者、其他疾病對(duì)照組及正常對(duì)照組的血小板分別與ECL和RCA-1孵育后上機(jī)檢測(cè)，測(cè)得ECL及

7、RCA-1結(jié)合百分比為去唾液酸化水平。
　　3.改良單克隆抗體特異性俘獲血小板抗原法（MAIPA）分析檢測(cè)ITP患者主要抗體類型，包括抗GPⅡbⅢa及GPⅠbα特異性自身抗體，對(duì)ITP患者進(jìn)行分類選擇。
　　4.患者治療方法：61例 ITP患者主要接受一線治療：首先地塞米松，劑量為40mg/d，3～5 d，不聯(lián)合或聯(lián)合大劑量靜脈丙種球蛋白，劑量為0.4 g·kg-1·d-1，3～5 d，后改為口服潑尼松，劑量為1mg·kg-

8、1·d-1，并據(jù)療效逐步減量，維持治療一個(gè)月以上，期間監(jiān)測(cè)血常規(guī)，觀察療效。療效的具體判斷標(biāo)準(zhǔn)為：①完全反應(yīng)(CR)：治療后血小板數(shù)≥100×109/L且沒(méi)有出血；②有效(R)：治療后血小板數(shù)≥30×109/L，并且至少比基礎(chǔ)血小板數(shù)增加兩倍，且沒(méi)有出血；③無(wú)效(NR)：治療后血小板數(shù)<30×109/L或者血小板數(shù)增加不到基礎(chǔ)值的兩倍或者有出血。按療效對(duì)患者分成CR、R、NR三組。
　　研究結(jié)果：
　　1.正常人與 ITP患

9、者這兩組在性別、年齡上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（性別：?2=2.796，P=0.094；年齡：t=-0.352，P=0.726），但兩組血小板計(jì)數(shù)的差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=21.914，P<0.001，ITP患者的血小板水平是明顯減低的。
　　2.正常人及ITP患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化水平（ECL，RCA-1）的差異有著顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），ITP患者血小板的膜表面糖蛋白去唾液酸化水平是明顯增高的。
　　

10、3.61例ITP患者按療效分成CR、R、NR三組，運(yùn)用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)方法分析，上述三組 ECL、RCA-1水平的比較，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。血小板去唾液酸化水平與ITP一線治療療效的spearman相關(guān)系數(shù)分析提示二者是相關(guān)的，ECL（r=0.391，P=0.002），RCA-1（r=0.395，P=0.002），提示去唾液酸化的指標(biāo)越高，療效越差。
　　4.因標(biāo)本留置問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)中的61例

11、 ITP患者中僅29例患者進(jìn)行了改良MAIPA方法檢測(cè)，對(duì)這29例ITP患者按照抗GPⅠbα抗體陽(yáng)性組、抗GPⅡb/Ⅲa抗體單陽(yáng)性組及雙抗體陰性組分為3組，運(yùn)用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)方法分析，各組ECL及RCA-1的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。
　　5.其他疾病對(duì)照組患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化水平分析：風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、MDS、AA和 AML其他疾病對(duì)照組的血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化水平與正常對(duì)照組比較均

12、有不同程度的升高（P<0.05），而 AML組的去唾液酸化水平與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異（P>0.05）。包括ITP在內(nèi)的五個(gè)疾病組之間去唾液酸化水平存在差異（P<0.05）。其中ITP、風(fēng)濕病及MDS去唾液酸化水平均較高。
　　結(jié)論：
　　1.ITP患者血小板膜糖蛋白去唾液酸化水平較正常人明顯升高；
　　2.ITP患者血小板膜糖蛋白去唾液酸化水平與一線治療療效相關(guān)，隨著ITP患者血小板膜糖蛋白去唾液酸化水平的提高，患

13、者的一線治療療效越差，肝臟內(nèi)的血小板破壞在 ITP的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位，支持了 ITP患者血小板清除的非Fc受體依賴途徑，利于對(duì)患者病情的判斷，治療方案的考慮選擇，為應(yīng)用神經(jīng)氨酸酶抑制劑治療ITP的提供了可能性；
　　3.由于進(jìn)行抗GPⅠbα抗體與ITP患者血小板膜糖蛋白去唾液酸化相關(guān)性分析的病例數(shù)較少，各抗體分組的 ITP患者去唾液酸化水平無(wú)差異，但是在兩組去唾液酸化水平的統(tǒng)計(jì)圖上可以看到存在抗 GPⅠbα抗體組的去唾液酸化

14、水平有略高的趨勢(shì)，由于這組數(shù)據(jù)較少，抗GPⅠbα抗體與去唾液酸化水平以及最終一線治療療效的關(guān)系有待后續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。
　　4.風(fēng)濕病組、MDS組、AA組的血小板膜糖蛋白去唾液酸化水平與正常對(duì)照組比較均有不同程度的升高，而AML組的去唾液酸化水平與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。ITP組的去唾液酸化水平與其他疾病對(duì)照組中的風(fēng)濕病組、MDS組及AA組的去唾液酸化水平相當(dāng)，與AL組比較存在差異，需要考慮風(fēng)濕病、MDS及AA這三組疾病在血