亞洲玉米螟Ⅳ家族幾丁質(zhì)酶的克隆表達(dá)、性質(zhì)表征及抑制劑研究.pdf

1、幾丁質(zhì)參與組成昆蟲(chóng)的外骨骼及圍食膜等結(jié)構(gòu)，其合成及降解過(guò)程的動(dòng)態(tài)調(diào)控對(duì)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。幾丁質(zhì)酶(EC3.2.1.14)是昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)降解過(guò)程的關(guān)鍵酶之一，負(fù)責(zé)將幾丁質(zhì)多糖降解為幾丁二糖及幾丁三糖。昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶是由一個(gè)龐大的基因家族編碼的，該酶分為八個(gè)家族，其中Ⅳ家族幾丁質(zhì)酶主要分布于中腸組織，對(duì)昆蟲(chóng)圍食膜的合成及降解、含幾丁質(zhì)食物的消化以及對(duì)外來(lái)病原體的免疫等方面發(fā)揮重要功能，可能作為綠色殺蟲(chóng)劑的潛在靶標(biāo)。因此，針對(duì)昆蟲(chóng)Ⅳ家族幾丁

2、質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)及抑制劑的研究，有助于了解其結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，并為綠色農(nóng)藥的設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴通過(guò)PCR擴(kuò)增及RACE等手段，得到了亞洲玉米螟來(lái)源的Ⅳ家族幾丁質(zhì)酶OfChtⅣ的cDNA序列。該cDNA序列全長(zhǎng)為1380 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)度為1218 bp，能夠編碼405個(gè)氨基酸，N-末端是長(zhǎng)度為18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，推測(cè)其為分泌蛋白。系統(tǒng)分析顯示OfChtⅣ與歐洲玉米螟Ⅳ家族幾丁質(zhì)酶OnChtⅣ親緣關(guān)系最近。⑵構(gòu)

3、建了OfChtⅣ的表達(dá)載體，并電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115細(xì)胞中。采用BMGY/BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)120 h時(shí)，發(fā)酵液上清的相對(duì)活力達(dá)到最大。將硫酸銨沉淀、凝膠過(guò)濾和金屬螯合層析聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)了重組ofChtⅣ的分離純化。⑶對(duì)重組OfⅣ進(jìn)行生化性質(zhì)表征。采用糖肽酶F處理OfChtⅣ，分析其具有N-糖基化現(xiàn)象。OfChtⅣ對(duì)pNP-β-(GlcNAc)2和膠體幾丁質(zhì)的最適pH均為酸性pH4.0;對(duì)膠體幾丁質(zhì)的Km值為13.11 mg·mL

4、-1，對(duì)pNP-β-(GlcNAc)2的Km值為0.21 mM。⑷萘酰亞胺類(lèi)化合物和殼聚糖對(duì)OfChtⅣ均具有一定的抑制活性。隨著聚合程度的增大，殼聚糖對(duì)OfChtⅣ的抑制活性也有所增強(qiáng)，其中殼五糖、殼六糖、殼七糖的IC50值分別為333.5μM、60.1μM和12.4μM。⑸20家族β-N-乙酰己糖胺酶是昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)降解系統(tǒng)中的另一種關(guān)鍵酶。針對(duì)亞洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶OfHex1，采用晶體結(jié)構(gòu)解析和分子對(duì)接等手段，對(duì)經(jīng)典抑制劑N