補腎法、疏肝法改善超促排卵小鼠子宮內膜容受性與調控MAPK家族信號通路的關系.pdf

1、目的：本研究通過觀察補腎法、疏肝法對超促排卵小鼠圍著床期子宮內膜VEGFR-2及其下游血管生成MAPK家族信號通路的影響，以探討兩種方法改善子宮內膜容受性的作用機制和環(huán)節(jié)之異同。
　　方法：將240只動情周期正常的雌性小鼠隨機分為正常組、模型組、補腎組、疏肝組，每組各60只。除正常組外，各組建立控制性超促排卵小鼠模型。補腎組、疏肝組分別從造模第1天開始灌胃補腎助孕方混懸液和逍遙丸混懸液。模型組和正常組給予同等劑量蒸餾水灌胃，連續(xù)1

2、1天。正常組于動情期，模型組、補腎組、疏肝組于注射HCG日，按雌:雄=2:1比例合籠飼養(yǎng)。次日晨見陰栓記為孕1d，各組孕鼠分別于孕2d、3d、4d、5d、6d取材，通過放射免疫法檢測小鼠血清中雌二醇（E2）、孕酮（P）含量；采用HE染色觀察小鼠子宮內膜厚度及形態(tài)學變化；掃描電鏡觀察小鼠子宮內膜胞飲突的形態(tài)，免疫組化法檢測小鼠子宮內膜雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、微血管密度（MVD）、VEGF、VEGFR-2、PCNA、Cycl

3、inD1、MMP-9蛋白表達，Western Blot法檢測小鼠子宮內膜ER、PR、PCNA、CyclinD1、MMP-9、VEGF、VEGFR-2及其下游血管生成相關分子蛋白表達，實時熒光定量PCR檢測VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9mRNA表達；統(tǒng)計比較各組小鼠陰栓率、妊娠率及胚胎著床數(shù)。
　　結果：
　　1.各組小鼠陰栓率、妊娠率及胚胎著床數(shù):與正常組比較，模型組小鼠陰栓率、妊娠率均下降

4、，胚胎著床數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義；與模型組相比，補腎組、疏肝組陰栓率、妊娠率均提高，且胚胎著床數(shù)增加；補腎組陰栓率、妊娠率及胚胎著床數(shù)較疏肝組增加，但兩組比較無統(tǒng)計學意義。
　　2.圍著床期各組小鼠雌孕激素及其受體水平比較:各組小鼠隨著妊娠天數(shù)的增加，血清E2、P值逐漸升高。孕第2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組小鼠血清E2值降低，差異有統(tǒng)計學意義；與模型組比較，補腎組、疏肝組血清E2值升高。孕第3、5天補腎組血清E2值

5、高于疏肝組，差異有統(tǒng)計學意義，其余各天兩組比較無統(tǒng)計學差異。孕第2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組小鼠血清P值降低，差異有統(tǒng)計學意義；與模型組比較，補腎組、疏肝組血清P值升高；補腎組與疏肝組比較無明顯統(tǒng)計學差異。ER、PR蛋白表達主要定位于小鼠子宮內膜腺體、間質的胞漿中。孕第2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組ER、PR蛋白表達降低；與模型組比較，補腎組、疏肝組ER、PR蛋白表達升高；補腎組與疏肝組之間比較表達無明顯差異。

6、
　　3.圍著床期各組小鼠子宮內膜厚度比較:各組小鼠隨著妊娠天數(shù)的增加，子宮內膜逐漸增厚。與正常組比較，模型組小鼠孕第2、3、4、5、6天子宮內膜厚度均明顯降低；與模型組比較，補腎組、疏肝組孕第2、3、4、5、6天子宮內膜厚度均顯著增加；補腎組與疏肝組比較，差異無統(tǒng)計學意義。
　　4.圍著床期各組小鼠子宮內膜形態(tài)學變化。HE染色顯示：正常組：小鼠隨著妊娠天數(shù)的增加，子宮內膜逐漸增厚；腺體數(shù)量增多，腺腔變大、彎曲，腺腔分泌物增

7、多；間質疏松水腫，基質細胞增大，在孕第4天后宮腔逐漸閉合，基質細胞增殖分化成蛻膜細胞。模型組：與正常組比較，子宮內膜較薄且發(fā)育不良，腺體少而小，腺腔擴張不明顯，腺腔分泌物較少；間質疏松水腫，相對致密，部分小鼠子宮內膜呈現(xiàn)腺體與間質發(fā)育不同步，間質呈分泌期改變而腺體發(fā)育仍為增生期。補腎組、疏肝組內膜發(fā)育與正常組接近，優(yōu)于模型組，兩組間比較無明顯差異。
　　5.圍著床期各組小鼠子宮內膜胞飲突的變化。胞飲突主要分布于子宮內膜腺體開口處。

8、正常組：孕第3天，部分子宮內膜細胞表面形成一些膜狀突起，突起表面有微絨毛覆蓋，絨毛短，稀疏，為發(fā)育中的胞飲突；孕第4天子宮內膜表面有大量均勻分布、邊界清楚的膜狀突起，表面光滑，無微絨毛覆蓋，為完全發(fā)育的胞飲突；孕第5天胞飲突表面皺縮，凹陷，微絨毛重新出現(xiàn)，為退化的胞飲突。模型組：孕第3天，胞飲突凸起較正常組明顯，微絨毛較短較稀疏，發(fā)育較正常組提前；孕第4天，子宮內膜胞飲突數(shù)量較正常組減少，表面皺縮，大小不一，整體發(fā)育不同步，未見完全發(fā)育

9、的胞飲突，提示胞飲突發(fā)育提前；孕第5天胞飲突皺縮較正常組明顯，微絨毛較少。補腎組、疏肝組：孕第3天，膜狀突起出現(xiàn)，表面覆有微絨毛；孕第4天為完全發(fā)育的胞飲突，較模型組表面相對飽滿、分布相對均勻；孕第5天胞飲突發(fā)育與正常組接近，為退化的胞飲突。
　　6.免疫組織化學法檢測MVD在不同分組之間的比較:CD34為血管密度標志物，表達于子宮內膜血管內皮細胞，用于測定MVD。孕第2、3、4、5、6天：與正常組相比，模型組MVD明顯下降；與模

10、型組比較，補腎組、疏肝組MVD顯著增加；與正常組比較，補腎組、疏肝組MVD降低。孕第6天，補腎組MVD高于疏肝組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　7.免疫組織化學法檢測VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白定位。VEGF、VEGFR-2蛋白在圍著床期小鼠子宮內膜的表達在空間上高度一致，主要定位在子宮內膜腔上皮、腺上皮細胞、間質細胞及血管內皮細胞的胞漿中；PCNA蛋白表達主要定位在子宮內膜腔上皮、間質細胞核內，

11、腺上皮細胞核有少量表達；CyclinD1主要表達于子宮內膜腔上皮、腺上皮的細胞核中，間質細胞核內表達較弱；MMP-9在子宮內膜的腔上皮、腺上皮及間質細胞漿中均有表達。
　　8.VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白及其mRNA時序表達規(guī)律。孕第2天VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白及其mRNA表達較低，之后逐漸上升，于孕第4天達到峰值，與其他時間點比較差異有統(tǒng)計學意義

12、，之后表達逐漸下降。
　　9.VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白及其mRNA表達結果在不同分組之間的比較。孕第2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組小鼠子宮內膜VEGF和VEGFR-2蛋白及其mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學意義；與模型組相比，補腎組、疏肝組VEGF、VEGFR-2蛋白及其mRNA表達明顯升高。但與正常組比較，孕第2、4、5、6天，補腎組、疏肝組VEGF蛋白及其mRNA表達降低，

13、孕第3、4、5、6天補腎組、疏肝組VEGFR-2蛋白及其mRNA表達降低。孕第6天補腎組VEGF、VEGFR-2蛋白及其mRNA表達高于疏肝組，差異有統(tǒng)計學意義，其余各天補腎組與疏肝組比較無統(tǒng)計學差異。孕第2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組小鼠子宮內膜PCNA蛋白及其mRNA表達低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義；與模型組相比，補腎組、疏肝組PCNA蛋白及其mRNA表達明顯增多。孕第2、3、6天，補腎組與正常組比較無統(tǒng)計學差異，孕第4

14、、5天補腎組低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義。孕第2、3、4、5天補腎組PCNA蛋白及其mRNA表達均高于疏肝組。孕第2、3、4、5、6天：與正常組相比，模型組小鼠子宮內膜CyclinD1蛋白及其mRNA表達明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義；與模型組相比，補腎組、疏肝組CyclinD1蛋白及其mRNA表達明顯升高；補腎組、疏肝組低于正常組，兩組間比較無統(tǒng)計學差異。孕第2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組小鼠子宮內膜MMP-9蛋白及其m

15、RNA表達下降，差異有統(tǒng)計學意義；與模型組相比，補腎組、疏肝組MMP-9蛋白及其mRNA表達明顯升高。孕第2、3、4、5天補腎組低于正常組，孕第2、4天疏肝組低于正常組，孕第2、3、4、5天疏肝組高于補腎組。孕第6天，補腎組、疏肝組、正常組比較無統(tǒng)計學差異。
　　10.Western Blot法檢測VEGFR-2下游MAPK家族信號通路蛋白表達。孕2、3、4、5、6天：與正常組比較，模型組p-ERK、p-P38、p-JNK蛋白表達

16、降低；與模型組比較，補腎組p-ERK、p-P38、p-JNK蛋白表達升高；疏肝組p-P38、p-JNK蛋白表達增強，差異有統(tǒng)計學意義，疏肝組p-ERK表達增強，但差異無統(tǒng)計學意義；疏肝組p-ERK蛋白表達較補腎組降低，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1.VEGF參與胚泡著床且在圍著床期表達具有時空特異性，可作為子宮內膜容受性評價指標。
　　2.控制性超促排卵降低圍著床期小鼠血清E2、P水平，影響ER、PR表達，使子

17、宮內膜腺體與間質發(fā)育不同步，胞飲突發(fā)育提前，下調VEGF及其受體，降低微血管密度，影響VEGFR-2下游MAPK家族3條信號通路，降低通路活性，減少磷酸化ERK、P38、JNK的表達，下調通路下游目的基因PCNA、CycinD1、MMP-9的表達，影響子宮內膜血管生成，降低子宮內膜容受性，導致妊娠率、著床率降低。
　　3.補腎法、疏肝法通過改善超促排卵小鼠血清E2、P水平及ER、PR表達，改善子宮內膜形態(tài)及胞飲突發(fā)育，上調VEGF

18、及其受體，改善微血管密度，調控VEGFR-2下游MAPK家族3條信號通路，增加通路活性，提高磷酸化ERK、P38、JNK的表達，促進通路下游目的基因PCNA、CycinD1、MMP-9的表達，促進細胞增殖遷移，有利于子宮內膜血管生成，改善子宮內膜容受性，從而提高小鼠妊娠率和著床率。
　　4.補腎法促進磷酸化ERK表達優(yōu)于疏肝法；補腎法在促進內皮細胞增殖，加速血管生成，改善子宮內膜容受性方面優(yōu)于疏肝法；疏肝法在水解細胞外基質(ECM