美洲大蠊抗腫瘤活性成分及其結(jié)腸定位片的研究.pdf

1、美洲大蠊Periplaneta americana（L.）為昆蟲綱（Insecta），蜚蠊目(Blattodea)，蜚蠊科(Blattaria)昆蟲的干燥全體。具有活血化瘀、解毒消疳、利水消腫等功效，含有蛋白質(zhì)、氨基酸、肽類、糖類等多種有效成分，現(xiàn)代研究表明，在抗癌、提高免疫力、治療心血管疾病、修復(fù)皮膚等方面具有顯著的作用。本論文在文獻(xiàn)及前期工作基礎(chǔ)上，以美洲大蠊為研究對(duì)象，富集純化其多肽類抗腫瘤活性成分，再根據(jù)多肽類成分在胃腸道中易被

2、酸解、酶解而失去藥效的性質(zhì)，采用新技術(shù)、新工藝將其研制成pH敏感型口服結(jié)腸定位片，主要研究內(nèi)容如下：
　　1.美洲大蠊抗腫瘤有效部位的制備工藝研究：采用指標(biāo)成分含量檢測(cè)結(jié)合體外腫瘤細(xì)胞抑制試驗(yàn)，確定了美洲大蠊有效部位的制備工藝條件為：取美洲大蠊藥材粗粉，石油醚除脂后，用10倍量90％的乙醇浸泡48h，以3ml/min/kg的速度進(jìn)行滲漉，收集滲漉液，濾過，濾液在50℃～60℃減壓濃縮至1:1（ml:g），藥液通過HP20大孔樹脂，

3、用2BV70%的乙醇進(jìn)行洗脫，收集70%乙醇洗脫液，并在50℃～60℃下減壓濃縮至1:2（ml:g），冷凍干燥即得多肽類凍干粉。
　　2.美洲大蠊凍干粉的初步質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究：采用紫外-可見分光光度法對(duì)凍干粉中氨基酸、多肽含量進(jìn)行測(cè)定；HPLC法對(duì)尿嘧啶、次黃嘌呤、肌酐含量進(jìn)行測(cè)定；對(duì)凍干粉中氨基酸的種類和含量進(jìn)行檢測(cè)；Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定了凍干粉中多肽的分子量，初步建立了美洲大蠊多肽類凍干粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

4、>　　3.美洲大蠊凍干粉的抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究：在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)其體內(nèi)抗腫瘤活性、荷瘤小鼠免疫功能及對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：美洲大蠊凍干粉各劑量組能抑制荷H22和S180瘤小鼠腫瘤生長，同時(shí)能提高荷瘤機(jī)體的免疫功能；可明顯誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，抑制其增殖，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，其機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值有關(guān)，初步揭示了美洲大蠊抗腫

5、瘤的作用機(jī)制。
　　4.美洲大蠊凍干粉結(jié)腸定位片的制備研究：根據(jù)美洲大蠊抗腫瘤活性多肽的性質(zhì)，為避免多肽成分在胃腸道中易被酸解、酶解而失去藥效，選擇pH敏感型包衣材料Eudragit S100將凍干粉制成結(jié)腸定位片劑，有利于藥物的吸收，發(fā)揮持久的藥效。在制備合格素片的基礎(chǔ)上，以肌酐的累積釋放度為指標(biāo)，確定具有結(jié)腸定位的包衣處方及包衣工藝參數(shù)，制備了美洲大蠊結(jié)腸定位片。三批樣品藥物的釋放行為相似，達(dá)到結(jié)腸定位釋放的目的，對(duì)樣品的釋藥

6、曲線進(jìn)行模型擬合，發(fā)現(xiàn)美洲大蠊凍干粉結(jié)腸定位片的體外釋藥行為符合威布爾模型。
　　本論文對(duì)美洲大蠊抗腫瘤活性多肽進(jìn)行初步分離，制備了美洲大蠊抗腫瘤活性部位；建立了凍干粉的初步質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)其進(jìn)行抗腫瘤機(jī)制的研究，成功研制了pH依賴型口服結(jié)腸定位片，經(jīng)體外釋放度試驗(yàn)證明能準(zhǔn)確定位到結(jié)腸，并滿足藥物溶出的要求，以期為臨床提供高效、低毒、多樣的用藥選擇。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.思路創(chuàng)新
　　本論文從美洲大蠊抗腫瘤有效部位

7、的提取與純化，凍干粉的制備，初步質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立，抗腫瘤作用及其機(jī)制的探討，結(jié)腸定位片的研制，形成“提取工藝—化學(xué)成分—藥效作用—成型工藝”的系統(tǒng)研究，為深入研究動(dòng)物類中藥新制劑提供新思路，具有創(chuàng)新性。
　　2.方法創(chuàng)新
　　本論文采用化學(xué)指標(biāo)與藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)相結(jié)合，對(duì)美洲大蠊抗腫瘤活性成分進(jìn)行富集和純化工藝；采用western-blot法、Elisa法、Hoechst33342/PI雙染法、Annexin V-FITC/PI

8、雙染法等分析方法對(duì)美洲大蠊有效部位體內(nèi)外抗腫瘤作用及機(jī)制進(jìn)行研究。在制備結(jié)腸定位片中，采用肌酐溶出度結(jié)合f2相似因子法對(duì)比不同處方、工藝條件的累積釋放曲線，對(duì)其體外釋藥相似性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為動(dòng)物類中藥美洲大蠊結(jié)腸定位釋放研究提供新方法，具有創(chuàng)新性。
　　3.應(yīng)用創(chuàng)新
　　本論文通過體內(nèi)抗腫瘤活性、荷瘤小鼠免疫功能及對(duì)體外腫瘤細(xì)胞凋亡的影響初步揭示其抗腫瘤作用的機(jī)制，為其抗腫瘤藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)；美洲大蠊抗腫瘤成分為多肽類活性成分