深海沉積物細菌和絲狀真菌的基因組學(xué)研究.pdf

1、海洋是地球上最重要的生態(tài)系統(tǒng)之一,其中蘊藏著種類繁多的微生物類群,是獲取新藥和新酶的寶貴資源,具有很好的開發(fā)前景。地球表面的60％被深度超過1000米的海水所覆蓋,并且深海區(qū)地球表面覆蓋著生物和非生物來源的深海沉積物。由于巨大的廣度和深度,海底沉積物和上部洋殼是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)之一,蘊藏著巨大的生物特別是微生物資源。海洋底部是一個極端環(huán)境,是嗜冷、嗜熱、嗜壓、嗜鹽和嗜低營養(yǎng)等嗜極端環(huán)境微生物的理想來源。對這些極端微生物的研究開發(fā)將會

2、在工業(yè)應(yīng)用、醫(yī)藥應(yīng)用、環(huán)境保護等方面具有潛在的、巨大的應(yīng)用價值。但是由于采樣和培養(yǎng)困難,對深海沉積物微生物資源的開發(fā)還遠遠不夠。因此,對深海沉積物中微生物資源的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)就具有重要的意義。
　　 本論文研究內(nèi)容首先是對一株分離自南沖繩海槽深海沉積物的細菌SM.A87進行了菌種鑒定。然后對菌株SM-A87進行了全基因組測序,以期通過基因組信息揭示其在深海沉積物PON降解中的作用。Pseudoalteromonas sp.SM991

3、3是從沖繩槽附近海域1855米深的海底沉積物中分離的深海適冷菌。能分泌大量的胞外多糖和適冷蛋白酶。本論文對其全基因組序列進行了測序和分析,并與南極淺海適冷菌Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125進行了比較基因組學(xué)的研究。以期發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌屬內(nèi)深海細菌對深海環(huán)境適應(yīng)的獨特機制。Trichodermapseudokoningii SMF2是分離自海灘土壤的一株絲狀真菌。其對線蟲有殺傷作用,并且其分泌的次

4、級代謝物哌珀霉素有抗菌和抗腫瘤活性。本論文對其基因組進行了測序和分析。希望能夠發(fā)現(xiàn)哌珀霉素的產(chǎn)生途徑并為以后的研究做好基礎(chǔ)。
　　 菌株SM-A87的菌種鑒定:SM-A87分離自南沖繩海槽深海沉積物海底表層下2米,海水深度為1245米。SM-A87革蘭氏染色為陰性,無游動和滑動能力。在海水LB平板上28℃培養(yǎng)48h后,菌落呈黃色到橘紅色,菌落圓形且緊貼平板,不透明,直徑2-3mm,高1.2mm。菌體細胞呈短桿狀,長約1.5-3.

5、3μm,寬約0.3-0.6μm。長期培養(yǎng)可形成球狀菌體。
　　 SM-A87是嚴(yán)格好氧菌,氧化酶和接觸酶陽性。產(chǎn)黃色色素,不形成芽孢。能在4-38℃范圍內(nèi)生長,最適生長溫度范圍為25-30℃。生長的pH范圍是pH5.0-8.5,能在0-12％的NaCl濃度下生長,最適生長NaCl濃度為3％。SM-A87含有黃桿菌科主要的呼吸醌MK-6。含有Flexirubin色素,主要合成末端分支的脂肪酸。
　　 SM-A87的DNA

6、G+C含量為35.8mol％。通過16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn),與SM-A87最相近的菌株為黃桿菌科的Salegentibacter holothuriorum,兩者的16S rRNA基因序列相似性為92.9％。另外,SM-A8716S rRNA基因序列與同屬于黃桿菌科的Mesonia algae和Gramella portivictoriae相似性分別為91.8％和91.5％。
　　 綜合傳統(tǒng)分類學(xué)、化學(xué)分類學(xué)和分子

7、系統(tǒng)學(xué)分類的結(jié)果,將SM-A87歸類為黃桿菌科的一個新屬新種,定名為Wangia profunda。最后屬名在InternationalJournal of Systematic and Evolutionary.Microbiology(IJSEM)Validation List no.116上更改為Zunongwangia。
　　 Zunongwangia profunda SM-A87基因組學(xué)研究:SM-A87的全基因組只

8、有一條染色體,長度為5128187bp,含有4653個預(yù)測的ORF,ORF平均長度為960bp。有47個tRNA基因和3個rRNA操縱子。是目前為止Bacteroidetes第一個被測序的深海沉積物細菌?；蚪M中含有糖酵解,戊糖磷酸途徑和三羧酸循環(huán)的全部基因以及ED代謝途徑的關(guān)鍵酶。這反應(yīng)了SM-A87代謝途徑的多能性。
　　 SM-A87可以產(chǎn)生大量的莢膜多糖,基因組分析發(fā)現(xiàn)其基因組有兩個多糖合成和輸出的基因簇。SM-A87可

9、以編碼大量分泌型的水解酶。其中在130個肽酶中,61個帶有信號肽。并且?guī)盘栯牡碾拿副炔粠盘栯牡碾拿父惺塞}特性,這有利于SM-A87在海水環(huán)境中對胞外蛋白質(zhì)進行更好的水解。其胞外肽酶主要以金屬肽酶和絲氨酸肽酶為主。SM-A87中與糖類分解和轉(zhuǎn)運相關(guān)的酶也比較多。因此,深海來源的Bacteroidetes的菌株具有很強的對胞外有機碳和有機氮降解的能力。
　　 SM-A87中有兩個CRISPR位點。第一個位點為5595bp,第二

10、個位點為2115bp。CRISPR被認為與抗病毒有關(guān),但是SM-A87的兩個CRISPR位點的間隔區(qū)序列在現(xiàn)有病毒庫中搜不到同源序列。這可能是由于現(xiàn)有病毒數(shù)據(jù)庫中僅包含了海洋病毒的很少一部分序列的因為。
　　 SM-A87能耐受0-12％的NaCl,是中度嗜鹽菌。嗜鹽蛋白具有比較多酸性氨基酸殘基從而使自身等電點比較低。通過預(yù)測SM-A87基因組全蛋白的等電點來預(yù)測其耐鹽特性。SM-A87胞外蛋白的等電點明顯低于胞內(nèi)蛋白的等電點,

11、說明其胞外蛋白比胞內(nèi)蛋白更具有嗜鹽性。同時也說明SM-A87胞內(nèi)的鹽離子濃度不是很高,很可能是通過富集有機物來維持其細胞內(nèi)外滲透壓平衡。其基因組能編碼甜菜堿轉(zhuǎn)運子也驗證了這個推論。
　　 Pseudoalteromonas sp.SM9913基因組及比較基因組學(xué)研究:P.sp.SM9913(簡稱 SM9913)是一株深海適冷菌,最適生長溫度為15℃。P.haloplanktisTAC125是分離自南極表層海水的適冷菌,并且基因組

12、已經(jīng)測序完成。SM9913基因組由兩條染色體組成,大小分別為3.3Mb(染色體Ⅰ)和700kb(染色體Ⅱ),與P.haloplanktis TAC125(簡稱TAC125)兩條染色體的大小和結(jié)構(gòu)都很相似。SM9913的兩個染色體共含有3711個ORF,其中66.9％可以注釋上已有的或預(yù)測的功能。62個tRNA基因和8個rRNA操縱子以及一個額外的5S rRNA基因都位于染色體I上。
　　 根據(jù)16S rRNA基因構(gòu)建的進化樹表明

13、SM9913和TAC125在進化關(guān)系上是非常接近的。SM9913和TAC125的平均核苷酸相似度為85％,說明SM9913和TAC125是假交替單胞菌屬不同的種但是具有很高的相似性。兩者共有2698個直系同源基因,分別占SM9913和TAC125全部基因的72.7％和77.4％。SM9913中共鑒定出了12個長度大于15kb的基因島(gene island,GI)。其中11個位于染色體Ⅰ,一個位于染色體Ⅱ?；驆u中的基因大部分是在TAC

14、125中沒有直系同源基因的SM9913特有基因,所以這些基因島的特有基因會賦予SM9913一些區(qū)別于TAC125的特性。
　　 與TAC125相比,SM9913中雙加氧酶個數(shù)比較少并且缺少TAC125中與H2O2抗性相關(guān)的脂肪酸代謝基因簇。因此推測SM9913對H2O2比較敏感。實驗結(jié)果也證實了這一點,SM9913只能在5mM H2O2濃度下生長,而TAC125可以在10-15mM H2O2濃度下生長。這可能是因為深海沉積物中氧