修飾的凹凸棒固定化醇脫氫酶及其在手性合成中的應用.pdf

1、生物催化是利用微生物代謝過程中產生的酶催化合成各種新的化合物和天然產物的過程。由于生物催化反應簡單易行和高效的特點，近來十多年，生物催化劑在有機合成中應用的數(shù)量快速的增加，特別是對于手性化合物的合成。在它們中間，醇脫氫酶（alcohol dehydrogenases，ADH，EC1.1.1.1）成為了焦點，它是一種氧化還原酶，在催化反應中具有很高的立體和區(qū)域選擇性，能催化還原一系列潛手性的酮酯轉化為相應的手性醇，而后者是合成藥物，農用化

2、學品，芳香劑的重要手性砌塊。 在生物催化反應中，使用游離的酶作生物催化劑，反應活性很高，但是反應產物提取和分離的過程復雜。而通過固定化后，酶的穩(wěn)定性提高，產物易于分離，并且還可以反復使用，降低了生產成本。因此，近年來在生物技術中固定化成為了研究熱點。 固定化酶的方法很多，常用的有吸附法，共價結合法，包埋法；所用的材料包括了合成的有機聚合物，生物高分子聚合物，無機材料等。為了克服有機材料機械強度低，穩(wěn)定性差的不足，本文

3、在參考文獻的基礎上，從透性化啤酒酵母細胞中提取醇脫氫酶，采用共價結合法，以衍生化的無機材料凹凸棒作為載體，固定化醇脫氫酶。 選擇凹凸棒（attapulgite，ATP）作為載體，利用了凹凸棒具有抗酸性，熱力學穩(wěn)定性和較高的機械強度的性能，來達到提高酶的pH，熱力學，操作和反復使用的穩(wěn)定性的目的。本文選擇了乙酰乙酸乙酯作為模型底物，用固定化醇脫氫酶作為生物催化劑，催化不對稱還原乙酰乙酸乙酯（ethyl acetoacetate，

4、EOB）為S型的3-羥基-丁酸乙酯（ethyl（S）-3-hydroxy butyrate，（S）-EOB）；主要對透性化啤酒酵母提取醇脫氫酶的影響因素，固定化醇脫氫酶以及催化不對稱合成S型3-羥基-丁酸乙酯的條件進行了研究；并且以游離和固定化醇脫氫酶的活性，不對稱還原反應的產物的產率、對應體過量值ee（enantiomeric excess）為指標，考察了分離提取的醇脫氫酶和固定化醇脫氫酶的穩(wěn)定性，及其他因素對催化合成的影響。對透性化

5、啤酒酵母中提取ADH的影響因素及提取的ADH穩(wěn)定性進行了研究 實驗結果表明，分離提取醇脫氫酶的過程中，細胞量與緩沖液的比（W：v）5：20，在5℃，pH7.5磷酸緩沖液中超聲破碎細胞，加入的硫酸銨為35％，所提取的ADH酶的活性最高達到105U/ml。穩(wěn)定性實驗表明，ADH粗提液的最適pH和溫度分別為7.0，25℃。通過紅外檢測，用氨基硅烷偶聯(lián)劑3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）對凹凸棒進行衍生化處理，得到了硅烷衍生化的凹凸

6、棒。 而制備固定化ADH中，最佳條件為：戊二醛的濃度0.5％，固定化溫度30℃，pH6.8。最后得到的固定化ADH酶的活性最高可以達到0.074U/mg。固定化ADH的穩(wěn)定性實驗表明，與游離的ADH相比，固定化后ADH穩(wěn)定性有明顯提高，它的最適溫度與pH值分別為35℃，pH7.5；在水浴中震搖32h，仍熱保持原有活性的58％。 催化不對稱合成實驗表明，在0.1M pH7.0的磷酸緩沖液中，反應2個小時，產物產率可以達