基因重組工具在腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用.pdf_第1頁(yè)
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1、腫瘤已成為全球首要致死原因,給人類社會(huì)帶來(lái)了沉重的疾病負(fù)擔(dān)。深入具體地認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制,將極大地協(xié)助大家精準(zhǔn)地治療腫瘤,提高患者生活質(zhì)量和生存時(shí)間。作為一種基因組不穩(wěn)定的體細(xì)胞遺傳病,腫瘤之間存在很大異質(zhì)性,并且本身處于不斷“進(jìn)化”的狀態(tài),這些特性使得鑒定、驗(yàn)證更多腫瘤相關(guān)基因,并實(shí)現(xiàn)靶向治療,依然是一件充滿挑戰(zhàn)的研究工作。
  本博士學(xué)位論文包括以下三項(xiàng)研究:
  1、為發(fā)現(xiàn)更多腫瘤抑制基因,我們?cè)O(shè)計(jì)并開(kāi)展了利用轉(zhuǎn)座

2、子在小鼠體內(nèi)篩選腫瘤抑制基因的工作。在Blm缺失背景的小鼠體內(nèi),我們利用piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)體細(xì)胞發(fā)生插入突變,干擾基因正常功能,從而誘發(fā)腫瘤生長(zhǎng)。接著,我們收集了腫瘤標(biāo)本,提取腫瘤基因組DNA,利用piggyBac序列標(biāo)簽克隆突變位點(diǎn),并分析篩選的候選腫瘤基因。我們發(fā)現(xiàn),小鼠體內(nèi)高頻次的轉(zhuǎn)座可以導(dǎo)致小鼠胚胎致死;中等頻率的轉(zhuǎn)座會(huì)引起小鼠出生后生長(zhǎng)發(fā)育異常;即使低頻次的轉(zhuǎn)座也會(huì)使小鼠整體生存周期縮短,并誘發(fā)腫瘤。在克隆piggyB

3、ac插入位點(diǎn)之后,我們可以看到,相比小鼠尾巴中轉(zhuǎn)座子的整合,腫瘤標(biāo)本中piggyBac插入位點(diǎn)存在明顯的富集現(xiàn)象,提示腫瘤克隆擴(kuò)增特性;piggyBac插入位點(diǎn)數(shù)量及其分布與已有研究比較一致;然而,在目前有限的腫瘤標(biāo)本及測(cè)序分析中,我們尚未發(fā)現(xiàn)明確的腫瘤抑制基因。本課題的開(kāi)展,提示我們利用piggyBac在體篩選腫瘤相關(guān)基因是可行;當(dāng)然,為使研究更深入,限定篩選腫瘤的類型并完善相關(guān)專業(yè)條件也需要考慮。
  2、為研究Cdk5rap

4、3在小鼠肝細(xì)胞癌發(fā)生中的作用,我們?cè)诟渭?xì)胞特異的Cdk5rap3條件性敲除小鼠中,利用DEN誘發(fā)肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng),通過(guò)與野生型小鼠觀察比較肝癌發(fā)生率及腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài),明確該基因缺失對(duì)肝癌發(fā)生的影響。觀察發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞特異地敲除Cdk5rap3顯著提高了小鼠肝癌發(fā)生率,其腫瘤生長(zhǎng)數(shù)量和質(zhì)量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型小鼠;讓人意外的是,病理分析發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中Cdk5rap3表達(dá)明顯升高,這些細(xì)胞并非來(lái)自基因敲除的肝細(xì)胞。這些結(jié)果提示我們,條件性敲除部分肝細(xì)

5、胞中Cdk5rap3可以顯著提高小鼠肝細(xì)胞癌易感性;這一表型的改變更多地來(lái)自肝臟內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用。
  3、我們利用全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)在Flt3-ITD敲入小鼠中存在一個(gè)耐藥變異(Flt3-ITDc.2076T>A)。為驗(yàn)證該變異會(huì)引起腫瘤細(xì)胞耐藥,我們克隆了cDNA,并將其回復(fù)為野生型堿基(Flt3-ITD c.2076T),在分別轉(zhuǎn)化了Ba/F3細(xì)胞系之后檢測(cè)了細(xì)胞對(duì)Quazartinib(AC220)

6、、Sorafenib和Ponatinib的敏感性。與預(yù)期一致,我們發(fā)現(xiàn),兩個(gè)編碼序列均可順利轉(zhuǎn)化Ba/F3細(xì)胞,均顯示了持續(xù)活化的激酶活性;與Flt3-ITD c.2076T相比,F(xiàn)lt3-ITD c.2076T>A使得腫瘤細(xì)胞對(duì)Quazartinib和Sorafenib表現(xiàn)出耐藥,而兩株細(xì)胞對(duì)Ponatinib均敏感,與已有報(bào)道結(jié)果一致。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了,F(xiàn)lt3-ITD敲入小鼠中發(fā)現(xiàn)的變異與人類白血病細(xì)胞FLT3中出現(xiàn)的Gate-kee

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