胞內(nèi)激活型熒光探針在腫瘤成像中的應(yīng)用及腫瘤靶向輸送基因載體的研究.pdf

1、第一部分:本實(shí)驗(yàn)研究了一種新型的雙功能靶向探針(FA-FITC-CathepsinSubstrate-Dabcyl簡(jiǎn)稱(chēng)FFCD1)用于檢測(cè)及定位癌癥細(xì)胞。由于Dabcyl高效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移淬滅作用，F(xiàn)FCD1在緩沖液中幾乎沒(méi)有熒光。但是，F(xiàn)FCD1可以在細(xì)胞內(nèi)被激活。對(duì)于葉酸受體表達(dá)量高的腫瘤細(xì)胞，探針FFCD1可以通過(guò)葉酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，隨后細(xì)胞內(nèi)的Cathepin B將淬滅劑Dabcyl和FITC切開(kāi)，從而使FITC

2、釋放出巨大的熒光。利用流式細(xì)胞分析技術(shù)及激光共聚焦顯微鏡，分析和觀察不同腫瘤細(xì)胞與熒光探針?lè)跤蟮慕Y(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)FFCD1對(duì)葉酸受體高表達(dá)的鼻粘膜上皮細(xì)胞(KB細(xì)胞)具有高度選擇性。同時(shí)，KB細(xì)胞與不同熒光探針的孵育實(shí)驗(yàn)，也進(jìn)一步驗(yàn)證了葉酸配基與腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體的高特異性結(jié)合能力。FFCD1“自激發(fā)”型熒光探針的特殊構(gòu)造，可以使與其發(fā)生特異性結(jié)合的腫瘤細(xì)胞變得可視化，與“永久開(kāi)放”型探針相比，可以克服正常組織內(nèi)非特異性酶的激活、高熒

3、光背景等缺點(diǎn)，提高腫瘤成像對(duì)比度和檢測(cè)靈敏度，使其在臨床腫瘤診斷及定位方面具有很大的潛力。
　　第二部分:基于DNA重組技術(shù)，我們?cè)O(shè)計(jì)和制備了三種多功能基因重組載體(H5WYG-3H1-NLS-TM, TM-4H1-NLS-GALA, KALA-2H1-NLS-TM)，可以靶向轉(zhuǎn)染特異性癌細(xì)胞。這種生物聚合物由四部分組成:(1)具有壓縮pDNA能力的、富含精氨酸、組氨酸的重復(fù)序列(H)，(2)靶向HER2受體高表達(dá)的癌細(xì)胞的序列(

4、TM)，(3) pH敏感的溶膜肽，用于破壞溶酶體膜，增強(qiáng)pDNA運(yùn)輸至細(xì)胞核的效率(FP)，(4)核定位序列(NLS)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)三種載體的制備難度、壓縮pDNA能力、靶向性和細(xì)胞毒性的比較，得出TM-4H1-NLS-GALA多功能基因重組載體，可以壓縮pDNA，避免pDNA被核酸酶降解，靶向HER2受體陽(yáng)性而非陰性的細(xì)胞系，并且能夠有效地到靶細(xì)胞的細(xì)胞核并調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。TM-4H1-NLS-GALA多功能基因重組載體對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯