近端胃癌中Caveolin-1基因的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制及其對表皮生長因子受體2活化的影響.pdf

1、目的：
　　胃癌(Gastric cancer，GC)是常見的上消化道惡性腫瘤，早期常無特異性癥狀，多數(shù)病人就診時(shí)已屬中晚期，治療效果差，死亡率較高，嚴(yán)重威脅著廣大人民的身體健康。研究表明，遠(yuǎn)端胃癌（Distal gastric cancer， DGC）的發(fā)病率呈下降趨勢，而近端胃癌（Proximal gastric cancer，PGC）的發(fā)病率則呈明顯增高的趨勢，尤其是中國北部的太行山脈。近端胃癌已成為河北省的高發(fā)腫瘤，并且具

2、有較強(qiáng)的家族聚集性。多年來，盡管對高發(fā)區(qū)胃癌的防治做了大量的工作，但其發(fā)病率和死亡率仍居高不下。因此，探索胃癌尤其是近端胃癌的發(fā)病機(jī)制及尋找有效的基因治療靶點(diǎn)，是降低胃癌發(fā)病率及死亡率的重要途徑。
　　Caveolin-1（Cav-1）基因位于人染色體7q31.2，編碼22KDa的具有腳手架功能的小凹蛋白，是細(xì)胞膜表面小凹結(jié)構(gòu)的主要成分。研究表明該蛋白鏈 N端的腳手架區(qū)域可通過識別特定的序列，與多種信號分子結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性，如受體

3、酪氨酸激酶等，影響多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，進(jìn)而參與了細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、增殖、侵襲等眾多惡性生物學(xué)行為。但Cav-1在不同的細(xì)胞環(huán)境下，其發(fā)揮的作用不盡相同。研究發(fā)現(xiàn)Cav-1的表達(dá)在不同腫瘤，同一腫瘤不同亞型或同一腫瘤發(fā)展的不同階段均是不同的。Cav-1在近端胃癌中的表達(dá)情況及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍未見報(bào)導(dǎo)。
　　表觀遺傳學(xué)改變，尤其是基因啟動子區(qū) CpG島的高甲基化現(xiàn)象是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的主要機(jī)制之一。在對多種腫瘤的研究中均發(fā)現(xiàn)了Cav-1基因的

4、甲基化失活現(xiàn)象，如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌等，然而，研究發(fā)現(xiàn)在不同的腫瘤中該基因的甲基化頻率及基因甲基化對轉(zhuǎn)錄的影響卻不盡相同。近些年，一些研究提出了關(guān)鍵性 CpG位點(diǎn)的概念，也就是說基因啟動子區(qū)每一個(gè) CpG位點(diǎn)的甲基化頻率并不相同，而與基因轉(zhuǎn)錄抑制密切相關(guān)的CpG位點(diǎn)稱為關(guān)鍵性CpG位點(diǎn)，可能位于CpG島內(nèi)或CpG島旁。關(guān)鍵性CpG區(qū)域的高頻率甲基化可通過阻礙多種轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合，降低或完全抑制了基因的轉(zhuǎn)錄水平，甚至還

5、可改變蛋白和DNA的相互作用，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。序列檢索軟件及CpG島預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)Cav-1基因在其啟動子區(qū)含有一較大的CpG島，推測基因甲基化可能是引起其表達(dá)異常的機(jī)制之一。本研究擬檢測Cav-1基因的甲基化水平對基因轉(zhuǎn)錄的影響以及其關(guān)鍵性CpG位點(diǎn)區(qū)域。
　　人類表皮生長因子受體（Human epidermal growth factor receptor， EGFR）是一類具有酪氨酸激酶活性的高同源性蛋白質(zhì)，該家族包括四

6、個(gè)成員，其中人表皮生長因子受體2（EGFR2；Her-2）是其主要成員之一。Her-2可通過與該家族的其它成員形成二聚體，并通過與EGFR樣配體結(jié)合，導(dǎo)致胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域上的酪氨酸磷酸化，進(jìn)而激活胞內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)如MAPK、PI3K/Akt、STAT、PLC等途徑，且作用較不含Her-2的異源二聚體更強(qiáng)。已有研究證實(shí)，Cav-1可直接與EGFR相連接，從而調(diào)控EGFR酪氨酸激酶的活性，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。而胃癌中Cav-

7、1對Her-2活化的影響尚未見報(bào)導(dǎo)。
　　本研究立足于河北省太行山脈上消化道腫瘤高發(fā)現(xiàn)場，收集大量散發(fā)性及家族聚集性近端胃癌患者的癌及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，并結(jié)合細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，以期明確（1）Cav-1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其關(guān)鍵性甲基化區(qū)域，并探討該基因關(guān)鍵性甲基化區(qū)域的甲基化狀態(tài)作為預(yù)后指標(biāo)的可行性；以期利用表觀遺傳學(xué)修飾的可逆性，為腫瘤的治療提供新的分子靶點(diǎn)，并為腫瘤的預(yù)后判斷提供新的線索。（2）Cav-1在胃癌中的具體作用及其對He

8、r-2活化的影響，探討Cav-1調(diào)控表皮生長因子受體2活化在胃癌發(fā)病中的作用，對于胃癌發(fā)病的分子機(jī)制的明確，提高患者的生存率具有重要意義。本研究擬分以下三個(gè)部分：
　　第一部分 Caveolin-1對體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制探討
　　方法：
　　1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理
　　常規(guī)培養(yǎng)BGC-823，MKN45，NCI-N87三株胃癌細(xì)胞株，待細(xì)胞密度較低且處于對數(shù)生長期時(shí)，分別用5μmol/

9、L的甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-Dc）處理72小時(shí)或0.3μmol/L組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹（trichostatin A，TSA）處理24小時(shí)，期間每24h更換一次培養(yǎng)液，處理完畢后更換為完全培基繼續(xù)培養(yǎng)，24h后收集細(xì)胞，提取DNA及RNA，進(jìn)行后續(xù)檢測。
　　2利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（ Transcription-Polymerase Chai

10、n Reaction，RT-PCR）的方法檢測不同胃癌細(xì)胞株中Cav-1基因mRNA的表達(dá)情況
　　常規(guī)培養(yǎng)BGC-823，MKN45，NCI-N87三株胃癌細(xì)胞株，并檢測藥物處理前后Cav-1基因mRNA的表達(dá)水平。
　　3利用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction，MSP）的方法檢測不同胃癌細(xì)胞株中 Cav-1基因的甲基化狀態(tài)
　　常規(guī)

11、培養(yǎng)BGC-823，MKN45，NCI-N87三株胃癌細(xì)胞株，并檢測藥物處理前后Cav-1基因的甲基化水平。
　　4建立Cav-1過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞株N87/Cav-1
　　將含人全長Cav-1基因的pcDNA3.1質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至低表達(dá)Cav-1的人胃癌細(xì)胞株NCI-N87中，經(jīng)G418抗性篩選，得到過表達(dá)Cav-1的穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞株N87/Cav-1及對照組細(xì)胞株N87/pcDNA3.1。
　　5 MTT

12、比色分析法檢測Cav-1過表達(dá)及5-Aza-Dc處理對NCI-N87細(xì)胞株細(xì)胞增殖能力的影響
　　將對數(shù)生長期的N87/pcDNA3.1及N87/Cav-1細(xì)胞以及5-Aza-Dc處理72小時(shí)后NCI-N87細(xì)胞分別消化并接種于96孔板，測定各孔吸光度值，檢測細(xì)胞的增殖能力。
　　6劃痕修復(fù)（Wound healing）實(shí)驗(yàn)檢測Cav-1過表達(dá)及5-Aza-Dc處理對NCI-N87細(xì)胞株細(xì)胞遷移能力的影響
　　將對數(shù)生

13、長期的NCI-N87、N87/pcDNA3.1及N87/Cav-1細(xì)胞分別消化并接種于24孔板，其中NCI-N87細(xì)胞株用5-Aza-Dc處理72h后，用10μl移液器吸頭垂直于孔底劃一條直線，顯微鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)劃痕愈合情況。
　　結(jié)果：
　　1不同胃癌細(xì)胞株在5-Aza-Dc及TSA處理前后Cav-1基因mRNA表達(dá)情況
　　利用RT-PCR的方檢測三株胃癌細(xì)胞株BGC-823，MKN45，NCI-N87中Cav

14、-1基因mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MKN45，BGC-823細(xì)胞株中Cav-1基因mRNA呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而NCI-N87細(xì)胞株中該基因呈弱表達(dá)。應(yīng)用甲基化抑制劑5-Aza-Dc處理三株胃癌細(xì)胞株后，發(fā)現(xiàn)MKN45及BGC-823細(xì)胞株中Cav-1基因mRNA表達(dá)沒有發(fā)生明顯變化，而NCI-N87細(xì)胞株在5-Aza-Dc處理后Cav-1基因mRNA表達(dá)明顯上調(diào)；而應(yīng)用組蛋白去乙?；敢种苿?TSA處理三株胃癌細(xì)胞株后，發(fā)現(xiàn) MKN45、BG

15、C-823及NCI-N87細(xì)胞株中該基因mRNA表達(dá)均無明顯變化。
　　2不同胃癌細(xì)胞株在5-Aza-Dc及TSA處理前后Cav-1基因不同區(qū)域甲基化狀態(tài)檢測
　　利用MSP的方法檢測MKN45、BGC-823及NCI-N87細(xì)胞株中Cav-1基因啟動子區(qū)不同區(qū)域的甲基化情況，結(jié)果顯示，應(yīng)用5-Aza-Dc處理前，胃癌細(xì)胞株NCI-N87四個(gè)檢測區(qū)域均可擴(kuò)增出甲基化條帶，處理后，四個(gè)區(qū)域的甲基化條帶均減弱或消失；而MKN45

16、、BGC-823在應(yīng)用5-Aza-Dc處理前后均未擴(kuò)增出甲基化條帶。
　　3過表達(dá)Cav-1基因及5-Aza-Dc處理對NCI-N87胃癌細(xì)胞株增殖能力的影響
　　利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測Cav-1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果表明，過表達(dá)Cav-1基因以及5-Aza-Dc處理后會導(dǎo)致NCI-N87細(xì)胞增殖能力明顯下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4過表達(dá)Cav-1基因及5-Aza-Dc處理對NCI-N87

17、胃癌細(xì)胞遷移能力的影響
　　采用Wound healing的方法檢測胃癌細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果表明，過表達(dá)Cav-1基因以及5-Aza-Dc處理后會導(dǎo)致NCI-N87細(xì)胞遷移能力明顯下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　第二部分近端胃癌組織標(biāo)本中Caveolin-1的異常表達(dá)及其甲基化狀態(tài)檢測
　　方法：
　　1研究對象：選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科2006年-2009年收治的近端胃癌患者172例，所有

18、患者均來自河北省上消化道腫瘤高發(fā)區(qū)。每例患者均取癌組織原發(fā)灶及距癌組織邊緣2~5cm處的癌旁組織。癌組織均為胃腺癌且癌組織的癌中心位于齒狀線上1cm及齒狀線以下2cm范圍內(nèi)；癌旁組織均為非腫瘤組織，包括正常黏膜組織和增生的黏膜組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過，并經(jīng)所有患者知情同意并簽署知情同意書。
　　2分別利用RT-PCR及免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）的方法檢測172例癌及癌旁組織標(biāo)本中C

19、av-1基因mRNA及蛋白表達(dá)的情況。
　　3利用MSP的方法檢測172例癌及癌旁組織標(biāo)本中Cav-1基因不同區(qū)域的甲基化狀態(tài)。
　　4應(yīng)用亞硫酸氫鈉測序法（Bisulfite Genomic Sequencing，BGS）的方法檢測5對癌及癌旁組織標(biāo)本中Cav-1基因每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化頻率。
　　結(jié)果：
　　1近端胃癌患者癌及癌旁組織標(biāo)本中Cav-1基因mRNA及蛋白的表達(dá)情況
　　RT-PCR的方法

20、檢測近端胃癌患者癌及相應(yīng)癌旁非腫瘤組織中 Cav-1基因mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，172例癌組織中Cav-1基因的mRNA表達(dá)量為0.418±0.143，其表達(dá)量明顯低于癌旁非腫瘤組織（0.684±0.219，t=-14.486，P=0.000）。
　　應(yīng)用 IHC法檢測172例近端胃癌患者癌及癌旁非腫瘤組織中 Cav-1蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示癌組織中 Cav-1蛋白的陽性表達(dá)率為39.5％（68/172），明顯低于癌旁組織

21、（77.3%，133/104，χ2=50.565，P=0.000）。
　　胃癌組織中Cav-1基因的mRNA及蛋白表達(dá)僅與上消化道腫瘤家族史相關(guān)（P<0.05），而與年齡、性別、病理分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P>0.05）。
　　2近端胃癌患者癌及癌旁組織中 Cav-1基因不同區(qū)域甲基化狀態(tài)的檢測
　　172例胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織均成功進(jìn)行了MSP檢測。結(jié)果顯示，癌及癌旁組織中Cav-1基因在MSP1，MSP

22、2，MSP3，MSP4四個(gè)區(qū)域的甲基化頻率分別為51.7%（89/172）和27.3%（47/172），23.8%（41/172）和1.2%（2/172），33.1%（57/172）和26.2%（45/172），45.3%（78/172）和37.8%（65/172），癌組織中四個(gè)區(qū)域的甲基化頻率均明顯高于癌旁非腫瘤組織，但僅有MSP1和MSP2兩個(gè)區(qū)域的甲基化差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2MSP1=21.451，P=0.000；χ2MSP2=

23、40.425，P=0.000）。
　　應(yīng)用BGS的方法對-590 bp~-143 bp以及-286~498bp兩個(gè)片段的52個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行了測序，結(jié)果顯示，腫瘤組織中每個(gè)GpG位點(diǎn)的甲基化頻率均高于癌旁組織相應(yīng)的CpG位點(diǎn)。
　　MSP1區(qū)域的甲基化狀態(tài)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及上消化道腫瘤家族史相關(guān)（P<0.05）；MSP2區(qū)域的甲基化狀態(tài)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及上消化道腫瘤家族史相關(guān)（P<0.05）；而MSP3、MSP4

24、兩個(gè)區(qū)域的甲基化狀態(tài)與各臨床病理參數(shù)均無關(guān)（P>0.05）。
　　3胃癌組織中Cav-1基因不同區(qū)域甲基化狀態(tài)對其mRNA及蛋白表達(dá)的影響
　　MSP1及MSP2區(qū)域發(fā)生甲基化的胃癌組中Cav-1基因mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯高于未發(fā)生該區(qū)域甲基化的胃癌組織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而MSP3及MSP4區(qū)域的甲基化狀態(tài)與Cav-1基因的mRNA及蛋白的表達(dá)無明顯相關(guān)性（P>0.05）。
　　4生存分析

25、>　　Cav-1蛋白表達(dá)與胃癌患者的生存期無關(guān)（χ2=2.698， p=0.100, Log-rank test）；Cav-1基因MSP1及MSP2兩區(qū)域發(fā)生甲基化的胃癌患者其五年生存率明顯高于未發(fā)生該區(qū)域甲基化的胃癌患者， Cav-1基因MSP1及 MSP2兩區(qū)域的甲基化狀態(tài)與胃癌患者的生存率有關(guān)（χ2MSP1=41.679，PMSP1<0.001；χ2MSP2=34.927，PMSP2<0.001；Log-rank test）；MS

26、P1、MSP2兩區(qū)域共同發(fā)生甲基化的胃癌患者較單一區(qū)域甲基化的患者或未發(fā)生甲基化的患者其預(yù)后更差（χ2=53.167，P<0.001, Log-rank test）；腫瘤分期為 III/IV期且合并 MSP1或 MSP2區(qū)域甲基化的胃癌患者（χ2=46.352，P<0.001， Log-rank test）或者上消化道腫瘤家族史陽性且合并 MSP1或 MSP2區(qū)域甲基化的胃癌患者（χ2=38.265， P<0.001， Log-rank

27、 test）其預(yù)后較差；COX分析結(jié)果顯示MSP1區(qū)域的甲基化狀態(tài)、TNM分期以及上消化道腫瘤家族史是近端胃癌患者獨(dú)立的預(yù)后因素（P<0.05）。
　　第三部分 Caveolin-1對體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株中Her-2活化的影響
　　方法：
　　1 Western blot法檢測不同胃癌細(xì)胞株中Cav-1及Her-2蛋白的表達(dá)情況
　　常規(guī)培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株AGS、MKN28、SGC7901、BGC823、MKN45、N

28、CI-N87，Western blot法檢測各細(xì)胞株中Cav-1及Her-2蛋白的表達(dá)水平。
　　2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立
　　選取 Her-2高表達(dá)而 Cav-1蛋白弱表達(dá)的 NCI-N87細(xì)胞建立 Cav-1過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系N87/Cav-1；Western blot法驗(yàn)證穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)果。
　　3 MTT比色分析法觀察配體誘導(dǎo)下Cav-1過表達(dá)對NCI-N87胃癌細(xì)胞株的增殖能力的影響。
　　將對數(shù)生長期的N87/pc

29、DNA3.1及N87/Cav-1細(xì)胞分別消化并接種于96孔板，細(xì)胞饑餓培養(yǎng)4h后，分別用不同濃度的EGF進(jìn)行刺激（0nM、4nM、20nM、100nM），48h后，加入 MTT，測定各孔吸光度值，檢測細(xì)胞的增殖能力。
　　4利用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察配體誘導(dǎo)下Cav-1過表達(dá)對NCI-N87胃癌細(xì)胞株遷移能力的影響
　　將對數(shù)生長期的N87/pcDNA3.1及N87/Cav-1細(xì)胞分別消化并接種于24孔板，饑餓4h后，用10μl移

30、液器吸頭垂直于孔底劃一條直線，分為無EGF刺激組和20nM EGF刺激組。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的遷移情況。
　　5平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測配體誘導(dǎo)下Cav-1過表達(dá)對NCI-N87細(xì)胞貼壁克隆生長的變化
　　選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的 N87/pcDNA3.1及 N87/Cav-1細(xì)胞，將細(xì)胞消化吹打?yàn)閱渭?xì)胞混懸液，接種于35mm培養(yǎng)皿（800個(gè)細(xì)胞/皿）。分別在有或無EGF（20nM）刺激下，蘇木素染色，顯微鏡下觀察，并計(jì)

31、算各組細(xì)胞克隆形成率。
　　結(jié)果：
　　1應(yīng)用 Western blot法檢測 AGS、MKN28、SGC7901、BGC823、MKN45、NCI-N87六株胃癌細(xì)胞系中 Cav-1蛋白及Her-2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：MKN28、SGC7901細(xì)胞株中Cav-1蛋白強(qiáng)表達(dá)，BGC823、MKN45 AGS、NCI-N87細(xì)胞株中Cav-1蛋白表達(dá)呈陰性或弱表達(dá)；而Her-2蛋白在MKN28、NCI-N87細(xì)胞株中呈陽

32、性表達(dá)，在其它細(xì)胞系中均為陰性或弱表達(dá)。
　　2選取Her-2高表達(dá)而Cav-1蛋白弱表達(dá)的NCI-N87細(xì)胞建立Cav-1過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系N87/Cav-1；Western blot法驗(yàn)證了穩(wěn)轉(zhuǎn)效果。
　　3在EGF配體誘導(dǎo)下Cav-1蛋白對NCI-N87細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　應(yīng)用MTT的方法檢測配體誘導(dǎo)下Cav-1蛋白對NCI-N87細(xì)胞增殖能力的影響，在不同濃度EGF（0nM，4nM，20nM，100 nM

33、）刺激下，Cav-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系 N87/Cav-1其細(xì)胞的增殖能力均明顯低于陰性對照組N87/pcDNA3.1（t0nM=13.718，P<0.001；t4nM=20.777，P<0.001；t0nM=12.623， P<0.001；t0nM=9.788，P<0.001）。
　　應(yīng)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測配體誘導(dǎo)下Cav-1過表達(dá)對NCI-N87細(xì)胞貼壁克隆生長的變化：經(jīng)10%胎牛血清及1%胎牛血清+20nMEGF培基培養(yǎng)2周后，過

34、表達(dá)Cav-1的N87/Cav-1細(xì)胞組較N87/pcDNA3.1細(xì)胞組細(xì)胞克隆形成能力減弱（59.183±5.982% vs.47.983±5.294%；36.583±4.147% vs.28.483±3.186%），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t10%胎牛血清=3.434，P<0.001；tEGF=3.794，P<0.001）。
　　利用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察配體誘導(dǎo)下Cav-1過表達(dá)對NCI-N87胃癌細(xì)胞株遷移能力的影響：結(jié)果顯示，在有

35、或無 EGF刺激下，過表達(dá) Cav-1的N87/Cav-1細(xì)胞其遷移能力在12h、24h、36h、48h時(shí)間點(diǎn)均低于陰性對照組N87/pcDNA3.1（P<0.05）。
　　4在配體誘導(dǎo)下Cav-1蛋白對Her-2活化的影響
　　預(yù)饑餓的 Cav-1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系 N87/Cav-1及陰性對照細(xì)胞系N87/pcDNA3.1分別接受 EGF（20 nM）刺激0、5、10、30分鐘，應(yīng)用Western blot檢測Cav-1、

36、Her-2、P-Her-2及抗磷酸化酪氨酸抗體4G10的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在有或無EGF刺激下，Her-2蛋白的總表達(dá)量無明顯變化，而Cav-1過表達(dá)細(xì)胞系N87/Cav-1對P-Her-2及4G10的表達(dá)量有明顯的抑制作用（P<0.05）。
　　5在配體誘導(dǎo)下Cav-1蛋白對MAPK、PI3K/Akt信號通路的影響
　　Western blot檢測 EGF刺激0、5、10、30分鐘后 N87/Cav-1及N87/pcDN

37、A3.1細(xì)胞株中 MAPK、PI3K/Akt信號通路的下游分子 ERK、P-ERK及Akt、P-Akt的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在EGF刺激下，P-ERK及P-Akt表達(dá)均較無EGF刺激時(shí)明顯增高；EGF刺激條件下N87/Cav-1細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)（5、10、30分鐘）P-ERK及P-Akt的磷酸化比率均明顯低于對照組N87/pcDNA3.1（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1 Cav-1基因CpG島旁及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)區(qū)域的高甲基化狀