慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默GTPBP4基因表達(dá)對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:根據(jù)GTPBP4基因序列設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)GTPBP4-siRNA，研究GTPBP4-siRNA對人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法:上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司的GTPBP4基因RNA干擾慢病毒載體LV-GTPBP4-RNAi及陰性病毒載體CON053，RNAi序列為GCGTAGTCTTGGTGTTGACAT;培養(yǎng)RKO細(xì)胞，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好并達(dá)到對數(shù)生長期時(shí)，于轉(zhuǎn)染前一日接種于6孔板，設(shè)實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組。實(shí)驗(yàn)

2、組加入慢病毒LV-GTPBP4-RNAi5ul，滴度為2×108 TU/ml，陰性對照組加入陰性病毒載體CON0535ul，滴度為2×108 TU/ml。慢病毒感染RKO細(xì)胞3天后，因慢病毒上攜帶報(bào)告基因GFP，故GFP的表達(dá)情況，判斷感染效率，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)板時(shí)收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。①判斷靶點(diǎn)的干擾效果可用Real-time PCR法檢測GTPBP4基因mRNA的表達(dá)情況:慢病毒感染5天后，立即抽提實(shí)驗(yàn)組及對照組的RKO細(xì)胞的總RNA

3、，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增，采用2-△△Ct分析法分析Real-timePCR數(shù)值。②用westem blot法檢測GTPBP4蛋白質(zhì)的表達(dá)情況:慢病毒感染5天后，提取實(shí)驗(yàn)組及對照組RKO細(xì)胞的總蛋白，以BCA法來測定蛋白濃度，以GAPDH蛋白為內(nèi)對照進(jìn)行SDS-PAGE電泳，免疫印跡（濕轉(zhuǎn)），抗體雜交，X光顯影分析結(jié)果。③感染5天后，用AnnexinⅤ-APC單染法流式細(xì)胞儀檢測檢測各組RKO細(xì)胞凋亡率。④用MTT法于

4、分板后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h5個時(shí)間點(diǎn)檢測各組RKO細(xì)胞的增殖情況。⑤用PI-FACS細(xì)胞周期檢測來檢測GTPBP4基因與RKO細(xì)胞周期分布的相關(guān)性。⑥通過感染后細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板上的克隆形成能力來提示慢病毒感染后細(xì)胞的成瘤能力。
　　結(jié)果:①用熒光顯微鏡在慢病毒感染3天后觀察，根據(jù)發(fā)綠色熒光的RKO細(xì)胞所占比率判斷慢病毒感染RKO細(xì)胞的效率達(dá)80％以上。②Real-time PCR法檢測結(jié)果:數(shù)值分析采

5、用2-△△Ct分析法，實(shí)驗(yàn)組2-△△Ct平均值為0.208，對照組的2-△△Ct平均值為1.002，顯示實(shí)驗(yàn)組RKO細(xì)胞中GTPBP4的mRNA表達(dá)水平顯著低于對照組(p＜0.05)。③westernblot結(jié)果:X光顯影后，可見各組內(nèi)對照GAPDH蛋白灰度相似，而實(shí)驗(yàn)組GTPBP4蛋白灰度值明顯低于對照組，顯示siRNA對目的基因的表達(dá)有敲減作用，根據(jù)灰度分析結(jié)果，敲減效率達(dá)到72.9％。④凋亡檢測顯示:慢病毒感染后，對于凋亡峰值實(shí)驗(yàn)

6、組細(xì)胞明顯高于對照組，且峰值出現(xiàn)時(shí)間早于對照組，表明實(shí)驗(yàn)組RKO凋亡細(xì)胞增加。⑤MTT法檢測結(jié)果:在24 h、48 h、72 h、96 h、120h5個時(shí)間點(diǎn)對照組OD值均值分別為1.00、1.54、2.61、4.15、8.09，實(shí)驗(yàn)組分別為1.00、1.49、2.23、3.12、6.33，顯示慢病毒感染后，實(shí)驗(yàn)組RKO細(xì)胞MTT值比值（即增殖倍數(shù)）減小，提示GTPBP4基因與RKO細(xì)胞的增殖能力顯著相關(guān)。⑥PI-FACS細(xì)胞周期檢測結(jié)

7、果:慢病毒感染后，處于G1期及G2/M期的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞顯著增多，而處于S期的明顯減少，提示GTPBP4基因與RKO細(xì)胞的周期分布相關(guān)。⑦細(xì)胞克隆形成檢測結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞集落數(shù)目平均值為63，對照組為106，顯示慢病毒感染后，實(shí)驗(yàn)組RKO細(xì)胞集落數(shù)目與對照組細(xì)胞集落數(shù)目相比減少，提示GTPBP4基因與RKO細(xì)胞的克隆形成能力相關(guān)。
　　結(jié)論:1.慢病毒介導(dǎo)的RNAi能高效感染RKO細(xì)胞，并有效抑制RKO細(xì)胞中相應(yīng)基因的表達(dá)。2.沉默G