不同藥物對NH4Cl誘導的肝細胞模型能量代謝影響.pdf

1、背景：
　　肝臟是人體葡萄糖、脂類、蛋白質(zhì)、維生素和激素等物質(zhì)代謝的重要器官，在人體生物轉化、解毒、代謝、消化、分泌、排泄和免疫過程中起著至關重要的作用。當肝臟功能受損，“殘存”的肝細胞不能滿足機體代謝需要時，導致機體代謝紊亂，例如乳酸中毒、血氨及吲哚水平升高等。慢加急性肝衰竭（ACLF）指在慢性肝臟疾病情況下，肝臟功能在短期（2-4周）內(nèi)出現(xiàn)嚴重受損，喪失其合成及解毒功能，從而導致黃疸、肝性腦病、凝血功能障礙和繼發(fā)多器官功能衰竭

2、的一組臨床癥候群[1]。其發(fā)病急，病情重，治療難度大，死亡率高[2]。目前認為血氨增高與慢加急性肝衰竭最主要的并發(fā)癥--肝性腦病的發(fā)生密切相關[3]。
　　血氨由機體組織中各種氨基酸分解代謝產(chǎn)生的氨以及由腸管吸收進來的氨進入血液而形成，目前認為血氨主要在肝臟經(jīng)鳥氨酸循環(huán)代謝成無毒的尿素排出體外[4]。慢加急性肝衰竭時，肝臟將氨合成為尿素的能力減退，引起血氨增高。升高的血氨可引起腦星形膠質(zhì)細胞腫脹、神經(jīng)遞質(zhì)合成及釋放障礙、增加氧化應

3、激等，增加肝性腦病、腦水腫、腦疝、癲癇等疾病的發(fā)生率，從而影響患者預后[5]。由于動脈血氨水平升高，肝衰竭患者會發(fā)生大腦能量代謝紊亂，包括糖酵解、三羧酸循環(huán)及氧化呼吸電子鏈等過程，從而導致能量缺失。Bhatia等的研究表明，動脈血氨濃度>124umol/L與重型肝性腦病和腦水腫的發(fā)生有關[6]。一般認為血氨升高僅僅與肝性腦病相關，尚無證據(jù)表明血氨能對肝細胞產(chǎn)生直接或間接影響，但本課題組的研究表明，血氨對肝細胞產(chǎn)生的影響遠比我們想象的多。

4、
　　眾所周知，在慢加急性肝衰竭中，大量肝細胞壞死，殘存的肝細胞功能維持是非肝移植患者生存和救治的希望，因此如何更好維護“殘存”肝細胞的功能，改善肝細胞能量供應、減輕線粒體損傷，也是目前肝衰竭支持治療重要的研究課題。我們前期研究的結果提示：肝衰竭引起的血氨升高不單單會引起“肝性腦病”，還會造成肝細胞以凋亡形式為主的損傷，抑制肝細胞的再生。臨床回顧性研究發(fā)現(xiàn)：早期、全程應用降血氨藥物能夠顯著緩解患者肝臟損傷、降低患者死亡率、改善患者

5、預后[7]。既往研究大多集中于氨對大腦細胞能量代謝的影響，而氨對肝細胞能量代謝的影響尚不清楚。本實驗通過高氨細胞模型的建立，揭示氨在肝細胞能量代謝過程中的作用，同時對比左卡尼汀、復方二氯醋酸二異丙胺、曲美他嗪對高氨誘導的肝細胞能量代謝影響。
　　目的：
　　1.建立高氨肝細胞模型，檢驗氯化銨是否對肝細胞產(chǎn)生毒性
　　2.應用濃度梯度的氯化銨處理培養(yǎng)的人正常肝細胞 chang liver細胞，檢測糖酵解及三羧酸循環(huán)過程中

6、化合物、酶的水平的變化，從而闡述氨對肝細胞的能量代謝影響
　　3.用左卡尼汀、復方二氯醋酸二異丙胺、曲美他嗪對高氨處理的肝細胞進行干預，檢測肝細胞生長狀況及細胞內(nèi)乳酸的變化。
　　方法：
　　氨中毒的細胞模型
　　1.CCK-8法檢測氨及三種藥物對肝細胞的毒性作用
　　2.ELISA法及生化自動分析儀檢測細胞內(nèi)糖酵解及三羧酸循環(huán)過程中乳酸、丙酮酸、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、乙酰COA的變化水平<

7、br>　　結果
　　隨氯化銨濃度的升高及作用時間的延長，氯化銨對 chang liver細胞的抑制率逐漸增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；隨氯化銨濃度的增加，細胞內(nèi)丙酮酸、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶含量升高，而丙酮酸脫氫酶、乙酰 COA的表達量降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；氯化銨可以引起細胞內(nèi)乳酸升高，其中以5mM NH4Cl引起乳酸濃度最高；用5mM NH4Cl及左卡尼汀、復方二氯醋酸二異丙胺、曲美他嗪處理人肝細

8、胞 Chang liver,左卡尼汀、復方二氯醋酸二異丙胺聯(lián)合處理組細胞增殖情況較氯化銨處理組升高（P<0.05)，而曲美他嗪不能改善氯化銨引起的肝細胞生長抑制現(xiàn)象；此外，左卡尼汀聯(lián)合處理組及復方二氯醋酸二異丙胺聯(lián)合處理組乳酸水平較氯化銨單獨處理組降低（P<0.05),其中左卡尼汀效果較好；而曲美他嗪聯(lián)合處理組則升高（P<0.05)。
　　結論：
　　1.氯化銨對肝細胞生長具有抑制作用，且隨濃度升高，抑制率增加。