NH4Cl對人肝細胞系LO2氨轉運相關蛋白RHCG和AQP8表達的影響.pdf

1、背景
　　肝臟是人體物質代謝的重要器官，具有代謝、解毒、排泄等重要功能。當肝臟發(fā)生嚴重病變時（如肝硬化、肝癌、重型肝炎），會嚴重影響機體正常的生理功能[1]。臨床工作中，血氨(bloodammoniaBA)對肝代謝功能的指示作用備受關注，其不僅可以反映肝病嚴重程度，還可以診斷肝性腦病。血氨的正常值是18～72umol/L，主要來源于腎臟分泌氨、腸道產(chǎn)氨、肌肉產(chǎn)氨等[2]。正常情況下體內氨主要代謝途徑是在肝臟中被合成尿素，然后經(jīng)腎臟

2、被排出體外。氨在腦、心肌、骨髂肌中的代謝途徑，則是在谷氨酰胺合成酶的催化作用下被合成谷氨酰胺，然后經(jīng)血液循環(huán)將合成的谷氨酰胺運輸?shù)礁闻K，再經(jīng)谷氨酰胺酶分解作用產(chǎn)生氨，最后被分解出來的氨在肝臟中參與尿素合成的鳥氨酸循環(huán)。當肝臟代謝出現(xiàn)病變時，其不能夠有效地代謝體內產(chǎn)生的氨，致使氨的積累，從而進一步加重肝臟的病變，引起更嚴重的病癥，如肝性腦病，甚至發(fā)生肝衰竭。與此同時，肝臟的損傷也會導致氨在體內的積聚，對機體產(chǎn)生較多影響，主要包括以下幾個方

3、面:1.氨引起星形膠質細胞腫脹;氨在體內、外均可引起星形膠質細胞腫脹。臨床研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質細胞腫脹是急性肝衰竭時腦水腫重要的細胞病理指標。2.由氨引起的能量代謝障礙。3.由氨引起的線粒體通透性轉換。4.由氨引起的氧化應激效應[3-5]。
　　最新研究發(fā)現(xiàn)，一類專性介導氨轉運的RH蛋白、甲氨透明質酸MEP(mythylaminepermease)和氨運載體AMT(ammoniumtransporter)共同構成了參與氨轉運的超級蛋

4、白家族。三種蛋白存在的主要位置有一定區(qū)別，其中RH糖蛋白主要表達于動物，MEP主要在酵母菌中表達，而AMT則主要表達于植物。RH糖蛋包括RHAG、RHBG、RHCG，其中RHAG為紅系相關性蛋白，RHBG和RHCG為非紅系相關性蛋白。然而，在人體內各器官中氨轉運蛋白主要為RHBG和RHCG。有研究發(fā)現(xiàn)RHBG和RHCG在腎臟和肝臟的氨的代謝和轉運中起關鍵作用[6]。此外還發(fā)現(xiàn)一組對水具有高選擇性的蛋白——水通道蛋白(AQP)，該蛋白主要

5、負責水的分泌吸收和維持細胞內外的水平衡，除此功能外，研究還發(fā)現(xiàn)此蛋白在一些特殊情況下還可對氨、CO2、Cl-、嘧啶、嘌呤、多元醇等具有通透性。到目前為止，在哺乳動物體內已發(fā)現(xiàn)的AQP就有13種，即AQPO～AQP12。AQP單體大小不同，分子量大小在25000～34000之間，每個AQP分子都包含有6個疏水的跨膜蛋白和5個連接環(huán)(A-E)，其一級結構是由肽鏈的氨基和羧基末端的重復結合構成，都具有天冬酰胺一脯氨酸一坷氨酸(NPA)特征性序

6、列。AQP在細胞膜上形成四聚體的立體結構，每個單體都含有一個水性孔道?，F(xiàn)研究已證明至少有7種AQP(0、1、3、4、8、9、11)的表達在肝臟細胞、膽道系統(tǒng)以及膽囊的生理學作用中起著重要作用。嚙齒類動物僅表達4種AQP(0、8、9、11)，然而在人的肝臟中除了這4種之外還表達AQP3。在動物的肝臟細胞中，AQP8表達最為豐富，且擁有多樣的亞細胞定位，包括滑面內質網(wǎng)膜、線粒體內膜、囊泡和小管質膜。在肝細胞中，存在兩類AQP8，一類AQP8

7、穿梭在接近于項質膜囊泡和小管質膜之間，而這種活動是由促膽汁分泌刺激素的控制;另一類是細胞內的AQP8，持久存在于肝細胞內部的線粒體和滑面內質網(wǎng)上[7-9];而細胞內滑面內質網(wǎng)的AQP8可能參與保持在肝組織中糖原合成和分解過程中細胞質內的滲透濃度。最新研究顯示，線粒體中的AQP8有著兩方面潛在作用:1.吸收NH4+供尿素循環(huán)使用[10];2.在活性氧產(chǎn)生的過程中從線粒體基質中釋放H2O2[11]。
　　目前有關高血氨對肝臟造成嚴重損

8、傷研究較多，主要有氨中毒學說[12]、血漿氨基酸代謝學說、假神經(jīng)遞質學說以及多種毒素相互協(xié)同作用，互為因果，相互依賴，共同促進肝性腦病的發(fā)生與發(fā)展，進而導致肝衰竭等[13-15];為此，探討并明確致病因素之間的相互作用有很重要研究意義。然而，就氨中毒學說機制中，關于氨的轉運機制國內外研究較少，而氨向肝細胞內的轉運對氨的細胞毒性至關重要。本研究構建氨中毒的細胞模型，并檢測氨轉運有關的蛋白RHCG和AQP8的表達情況，初步探索氨在肝臟內轉運

9、及毒性機制，以期能為氨毒性機制的進一步研究提供理論基礎[16]，并為臨床肝衰竭的治療提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　檢驗氯化銨是否能夠特異性地刺激肝細胞，使其內部與氨離子轉運有關的RHCG和AQP8基因表達發(fā)生變化。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)人正常肝臟細胞(LO2)、甲狀腺癌細胞（TPC-1）、卵巢癌細胞(SKOVR-3)和食管癌細胞(9706);
　　2.NH4Cl（2.5、5、10、20、40和50mm

10、ol/L）對4種細胞作用24h后，MTT法檢測細胞的增殖;
　　3.熒光定量PCR和蛋白免疫印跡技術檢測LO2細胞經(jīng)5、10和20mmol/L的NH4Cl處理不同時間（6、12和24h）后，AQP8和RHCG基因的表達;以及處理不同時間（12、24和48h）后，AQP8和RHCG蛋白的表達;
　　4.10mmol/L的NH4Cl處理TPC-1、SKOVR-3和9706細胞不同時間(6、12和24h)后，AQP8和RHCG基因

11、的表達;以及處理不同時間（12、24和48h）后，AQP8和RHCG蛋白的表達;
　　結果:
　　1.隨著NH4Cl濃度的增加，氨對肝細胞LO2的增殖抑制率逐漸增加且明顯大于其他細胞系;
　　2.10mmol/LNH4Cl作用于LO2細胞6h時，RHCG基因表達量明顯下調(p＜0.05)，而AQP8基因的表達量在作用12h后較對照組明顯增加（p＜0.05）;
　　3.10mmol/LNH4Cl作用于LO2細胞24

12、h時，AQP8蛋白表達量較對照組顯著增加(p＜0.0.5)，而RHCG無變化;
　　4.相同濃度NH4Cl作用于TPC-1、SKOVR-3和9706細胞系相同時間時，AQP8和RHCG的基因和蛋白水平均未見顯著性變化。
　　結論:
　　氯化銨能夠特異性地刺激肝細胞，導致其內部與氨離子轉運有關的RHCG和AQP8基因表達發(fā)生變化，具體如下:
　　1.高氨環(huán)境會對肝細胞造成特異性損傷。
　　2.在氨升高的環(huán)境中