AQP8在人羊膜上皮細胞WISH株中的表達及調控機制研究.pdf

1、目的：羊水膜內轉運是羊水吸收的重要調節(jié)方式，對羊水量的平衡起了重要作用，但其細胞和分子機制還不清楚。通過研究人羊膜上皮細胞AQP8的表達和調控，探討羊水跨膜轉運機制，為臨床羊水量異常尋找治療策略提供理論依據(jù)。 方法：(1)培養(yǎng)人羊膜上皮細胞WISH株。隨機分為實驗組和對照組，對照組予以正常培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。實驗組分為3組：低滲組、高滲透組、環(huán)磷酸腺苷(cycliadenosinemonophosphate,cAMP)組。低滲透組將

2、細胞培養(yǎng)液稀釋至80％，60％兩組，繼續(xù)培養(yǎng)羊膜上皮細胞；高滲組將細胞培養(yǎng)液濃縮至120％，140％兩組，繼續(xù)培養(yǎng)羊膜上皮細胞；cAMP組將8-Br-cAMP加入培養(yǎng)液，使其在細胞培養(yǎng)液中濃度分別為10μM、20μM、40μM、100μM、200μM、400μM，分別培養(yǎng)羊膜上皮細胞。各組分別在培養(yǎng)2h、4h、8h、16h、24h和48h時取樣。各組重復培養(yǎng)6瓶。(2)采用Westernblot技術定量檢測WISH細胞AQP8蛋白表達。

3、(3)采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術半定量檢測WISH細胞AQP8mRNA的表達。(4)采用免疫熒光組織化學方法原位檢測WISH細胞上AOP8的分布。 結果：(1)實驗組和對照組WISH細胞均能表達較低水平的AQP-8mRNA和蛋白，WISH細胞AQP8蛋白以糖基化形式存在。WISH細胞AQP8蛋白主要定位在細胞內，而在細胞膜的表達卻相對較少。(2)各低滲組細胞AQP8mRNA和蛋白的表達水平均明顯高于對照組(P<0

4、．05)，各高滲組細胞AQP8mRNA和蛋白表達水平均明顯低于對照組(P<0．05)；在不同滲透狀態(tài)下的不同培養(yǎng)時間，AQP8mRNA和蛋白表達隨低滲程度的增加而增加，隨高滲程度的增加而降低(P<0．05)。熒光顯微鏡觀測低滲液培養(yǎng)的細胞其細胞膜上的熒光明顯增強，細胞內的熒光明顯減弱；高滲液培養(yǎng)的細胞其細胞膜上的熒光明顯減弱而細胞內的熒光明顯增強(3)8-Br-cAMP孵育的細胞隨著其濃度的升高AQP8蛋白水平明顯升高(P<0．05)。

5、培養(yǎng)液中8-Br-cAMP為20μM～200gM時，其蛋白水平增加2～5倍，在200μM時達到峰值。AQP8蛋白水平在8h就開始增加，在24h達到峰值，增加約5倍。8-Br-cAMP孵育的細胞隨著其濃度的升高AQP8mRNA水平明顯升高(P<0．05)。培養(yǎng)液中8-Br-cAMP為20μM～200μM時，其mRNA水平增加2～5倍，在200μM時達到峰值。AQP8mRNA水平在2h就開始增加，在8h達到峰值，16h開始下降，24h降到8

6、-Br-cAMP孵育前的水平。8-Br-cAMP孵育的細胞，細胞內的熒光減弱而細胞膜的熒光明顯增強。 結論：(1)WISH細胞有AQP8mRNA和蛋白表達，其表達水平與文獻報道的人羊膜上皮細胞相似。表明WISH細胞可以作為研究羊膜AQP8水轉運及調控機制的細胞模型。(2)隨著羊水滲透壓的改變，WISH細胞的AQP8蛋白基因表達及分布發(fā)生相應的改變，從而改變細胞對水的通透性，調節(jié)羊水重吸收。(3)8-Bt-cAMP刺激WISH細胞