人羊膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)工藝及向肝樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的：建立人羊膜上皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)與凍存工藝，研究其基本的生物學(xué)特性，并進行人羊膜上皮細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的研究。
　　方法：無菌條件下收集剖宮產(chǎn)新生兒的羊膜，采用正交法對不同的分離、培養(yǎng)與凍存條件設(shè)計適宜的因素水平，采用與之相對應(yīng)的正交表進行試驗。以相同質(zhì)量羊膜所得SSEA-4陽性細(xì)胞量為對照，研究胰酶濃度、消化時間與消化次數(shù)等影響因素對分離效果的影響;以SSEA-4陽性細(xì)胞量/細(xì)胞接種量為對照，研究細(xì)胞接種密度、血清濃度與細(xì)胞生

2、長因子EGF濃度等影響因素對培養(yǎng)效果的影響;以復(fù)蘇細(xì)胞存活率為對照，研究細(xì)胞凍存密度、DMSO濃度與血清濃度等影響因素對凍存效果的影響。以此提出優(yōu)化的人羊膜上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)與凍存工藝。取原代、傳代及凍存復(fù)蘇細(xì)胞做形態(tài)學(xué)觀察，繪制細(xì)胞生長曲線，對原代細(xì)胞作相關(guān)表面標(biāo)志物的免疫熒光染色，并對原代及P4代細(xì)胞作免疫流式細(xì)胞檢測。取P1代人羊膜上皮細(xì)胞向肝樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)組在5％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中加入20ng/ml HGF、1

3、0ng/ml FGF4、10ng/ml IGF-1、500nM Dex誘導(dǎo)試劑組合，對照組只加入5％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，誘導(dǎo)周期為三周。鏡下對比誘導(dǎo)細(xì)胞與對照細(xì)胞形態(tài)的變化，誘導(dǎo)過程中細(xì)胞免疫熒光染色的變化，逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR檢測誘導(dǎo)過程中肝細(xì)胞相關(guān)基因AFP、ALB、 HNF4α與CYPlA2表達量的變化，并對誘導(dǎo)3周后hAECs細(xì)胞作糖原染色檢測。
　　結(jié)果：經(jīng)正交法數(shù)據(jù)分析得到，優(yōu)化的胰酶消化羊膜上皮細(xì)胞的分

4、離條件為:胰酶濃度0.25％，分4次消化，每次消化時間20min，分離因素影響大小依次為:消化次數(shù)＞消化時間＞胰酶濃度。優(yōu)化的培養(yǎng)條件為:細(xì)胞接種密度為4×105/ml，EGF濃度為10ng/ml，血清濃度為5％，培養(yǎng)因素影響大小依次為:細(xì)胞接種密度＞血清濃度＞EGF濃度。優(yōu)化的凍存條件為:細(xì)胞凍存密度為1×107/ml，DMSO濃度為10％，血清濃度為80％。凍存因素影響大小依次為:DMSO濃度＞細(xì)胞凍存密度＞血清濃度。原代接種細(xì)胞2

5、-3d內(nèi)下沉貼壁生長，貼壁后呈扁平不規(guī)則多角形，以鋪路石樣生長。傳代后細(xì)胞貼壁與生長速度加快，凍存復(fù)蘇的P2代細(xì)胞生長與擴增能力無明顯下降。免疫熒光染色顯示，原代細(xì)胞強表達CK19、SSEA-4，不表達Vimentin、CD45和HLA-DR。統(tǒng)計原代及P4代細(xì)胞流式檢測數(shù)據(jù),P4代細(xì)胞中SSEA-4與CK19免疫陽性細(xì)胞百分率較原代細(xì)胞有顯著減少(P＜0.0001);而Vimentin和CD105較原代細(xì)胞有顯著增加(P＜0.0001

6、);P4代與原代細(xì)胞的CD73免疫陽性細(xì)胞百分率均很高，且無顯著性差異(P=0.162＞0.05);HLA-DR在原代或P4代細(xì)胞中均不表達。人羊膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)2周后，細(xì)胞由橢圓形逐漸向多角扁平形狀轉(zhuǎn)變，細(xì)胞折光性增加。經(jīng)免疫熒光染色顯示，誘導(dǎo)1周后AFP表達量大，但3周后有明顯下降;誘導(dǎo)3周的ALB和CK18的表達量均較1周的有明顯增加;而SSEA-4的表達量逐漸減弱。熒光定量PCR采用2-△△Ct法對各基因進行相對定量顯示，誘導(dǎo)1周

7、后人羊膜上皮細(xì)胞的AFP相對表達量顯著大于誘導(dǎo)前(P＜0.05)，誘導(dǎo)3周后，AFP相對表達量又顯著降低(P＜0.05);誘導(dǎo)3周后，ALB、HNF4α和CYP1A2三種基因的相對表達量均顯著大于誘導(dǎo)前(P值均小于0.05)。
　　結(jié)論：建立了人羊膜上皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)與凍存的優(yōu)化工藝。人羊膜上皮細(xì)胞易于獲得且體外增殖能力強，表達胚胎干細(xì)胞保持未分化狀態(tài)的表面標(biāo)志物。體外可誘導(dǎo)向肝樣細(xì)胞分化，表達肝細(xì)胞特異性基因，具備肝細(xì)胞特有功能