人羊膜上皮細(xì)胞的干細(xì)胞特性及其在不同濃度維甲酸誘導(dǎo)下分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:1.建立人羊膜上皮細(xì)胞(HAECs)的分離培養(yǎng)體系，對(duì)人羊膜上皮細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)、鑒定、純化及擴(kuò)增。
　　2.探索人羊膜上皮細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞特性，研究其誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的潛能。
　　3.探索維甲酸誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的最優(yōu)濃度。
　　方法:1.人羊膜清洗剪碎后先經(jīng)0.25％Ⅱ型膠原酶消化2小時(shí)，然后經(jīng)0.25％胰酶/0.02％EDTA消化15min后，將細(xì)胞懸液以1×107個(gè)/ml

2、的密度接種到25ml培養(yǎng)瓶中，倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞變化;免疫組化和免疫熒光方法鑒定貼壁細(xì)胞是否為人羊膜上皮細(xì)胞。
　　2.采用免疫組化方法鑒定胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)記SSEA-4，Oct-4和神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記nestin和musashi在體外培養(yǎng)的人羊膜上皮細(xì)胞(HAECs)中的表達(dá)情況。
　　3.實(shí)驗(yàn)組使用不同濃度（1×10-8M、1×10-7M、1×10-6M、1×10-5M）的維甲酸在體外誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞（HA

3、ECs），未加入維甲酸干預(yù)的為對(duì)照組。7天后，采用免疫組化、western-blotting、RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)記Oct-4、神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記nestin、神經(jīng)元特異性標(biāo)記MAP-2和膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記GFAP的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:1.倒置相差顯微鏡觀察到分離的細(xì)胞2-3天后貼壁，之后細(xì)胞逐漸變大，折光性降低，整個(gè)細(xì)胞輪廓變暗，完全伸展的細(xì)胞形態(tài)多樣，呈梭形、

4、多角形、眼睛樣等，輪廓清晰，胞漿豐富，胞核呈圓形、卵圓形，核居中。3d后，人羊膜上皮細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，呈不規(guī)則的多角形，5d-7d左右90％細(xì)胞融合成片，形成單層放射狀或漩渦狀生長(zhǎng)。細(xì)胞免疫組化和免疫熒光顯示全部的貼壁細(xì)胞內(nèi)上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物CK19表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，而間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物vimentin僅在部分細(xì)胞內(nèi)弱陽(yáng)性表達(dá)。
　　2.體外培養(yǎng)的人羊膜上皮細(xì)胞內(nèi)胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)記SSEA-4，Oct-4和神經(jīng)

5、干細(xì)胞特異性標(biāo)記nestin和musashi表達(dá)陽(yáng)性
　　3.細(xì)胞免疫組化、蛋白印跡技術(shù)和Real-timePCR結(jié)果免疫組化結(jié)果:與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中胚胎干細(xì)胞標(biāo)記Oct-4表達(dá)降低，神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記nestin、神經(jīng)元特異性標(biāo)記MAP-2和膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記GFAP的表達(dá)升高;各實(shí)驗(yàn)組相比較，隨著維甲酸濃度的升高，胚胎干細(xì)胞標(biāo)記Oct-4表達(dá)逐漸降低，神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記nestin、神經(jīng)元特異性標(biāo)記MAP-2和膠質(zhì)細(xì)胞

6、特異性標(biāo)記GFAP的表達(dá)逐漸升高。實(shí)驗(yàn)組中加入10-5M的維甲酸誘導(dǎo)后細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡樣改變，大量細(xì)胞固縮脫落，并可見部分細(xì)胞碎片。蛋白印跡結(jié)果:隨著維甲酸濃度增高，Nestin，MAP-2和GFAP在蛋白水平表達(dá)逐漸增高，而OCT-4蛋白表達(dá)逐漸降低。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組nestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表達(dá)均明顯增加，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組中1×10-7M較1×10-8Mnestin蛋白、MAP-2蛋白

7、和GFAP蛋白表達(dá)增多，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);1×10-6較1×10-7Mnestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表達(dá)增多，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);1×10-5M較1×10-6Mnestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表達(dá)增多，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組Oct-4蛋白表達(dá)均明顯降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組中1×10-7M較1×10-8MOct-4蛋白表達(dá)降低，且有

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);1×10-6M較1×10-7MOct-4蛋白表達(dá)降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);1×10-5M較1×10-6MOct-4蛋白表達(dá)降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。Real-timePCR結(jié)果:與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組nestinmRNA、MAP-2mRNA和GFAPmRNA表達(dá)均明顯增加，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組中1×10-7M較1×10-8MnestinmRNA、MAP-2mRNA和GF

9、APmRNA表達(dá)增多，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);1×10-6M較1×10-7MnestinmRNA、MAP-2mRNA和GFAPmRNA表達(dá)增多，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);1×10-5M較1×10-6MnestinmRNA、MAP-2mRNA和GFAPmRNA表達(dá)增多，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組Oct-4mRNA表達(dá)均明顯降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組中1×10-7M較1×10-8M

10、Oct-4mRNA表達(dá)降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);1×10-6較1×10-7MOct-4mRNA表達(dá)降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);1×10-5較1×10-6MOct-4mRNA表達(dá)降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論:1.體外成功完成人羊膜上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定、純化和擴(kuò)增。
　　2.人羊膜上皮細(xì)胞能夠表達(dá)胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志，具有胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞特性，并可能具有向神經(jīng)樣