微囊藻毒素--LR對α4過表達的人肝細胞系HL7702的影響.pdf

1、背景:隨著經濟的高速發(fā)展，由人類經濟活動產生的水體富營養(yǎng)化及其所造成的水華暴發(fā)成為全球關注的重要環(huán)境問題。水華暴發(fā)時，大量繁殖的藻類所產生的次生代謝物微囊藻毒素(microcystins，MCs)對水生生物和人類具有健康威脅。在超過100種的MCs異構體中，微囊藻毒素-LR(microcystin-LR，MC-LR)是最為常見且毒性最強的一種，肝臟是其主要的靶器官。MC-LR可以引發(fā)一系列的肝毒性，包括誘導肝細胞壞死、凋亡、肝出血等。目

2、前認為，MC-LR的主要致毒機理是通過抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A，PP2A)的活性從而產生一系列的細胞毒性作用。PP2A是細胞內主要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，參與了包括細胞骨架動態(tài)調控在內的多種細胞生命活動。α4是PP2A一個重要的調節(jié)蛋白，它能對PP2A進行多種調節(jié)，包括調節(jié)PP2A活性和促進PP2A核心酶組裝。α4的過表達能夠促進細胞增殖和細胞存活。α4還對細胞骨架具有一定調節(jié)作用。本實驗室前期

3、發(fā)現MC-LR能夠在多種細胞系中誘導細胞骨架發(fā)生重構，這可能與其抑制PP2A活性有關。隨后，我們在人胚腎293細胞(HEK293)內觀察到低濃度MC-LR引發(fā)了PP2A活性應激性上調，這一現象可能與α4和PP2A/C亞基結合的改變有關，暗示α4參與了對MC-LR細胞毒性效應的調節(jié)過程。將HEK293細胞內α4蛋白過表達后，本實驗室最近還觀察到MC-LR對細胞骨架的破壞作用消失了，提示在MC-LR毒性效應下α4的過表達提高了HEK293內

4、細胞骨架的穩(wěn)定性，這引發(fā)了我們如果在其它細胞系中過表達α4是否具有同樣效應的思考。
　　目的：本實驗將探究MC-LR處理α4過表達的人肝細胞系7702(HL7702)后產生的各種細胞效應，這有助于更好地闡明MC-LR毒性效應下α4，PP2A和細胞骨架的關系。
　　方法:利用lipofectamineTM2000將α4表達質粒載體轉入HL7702內24h后，再分別用不同濃度的MC-LR（0μM，1μM和10μM）處理24h?？?/p>

5、載質粒作為空載對照組。應用酶活性測定試劑盒、免疫印跡技術、免疫熒光技術和免疫共沉淀技術對本實驗條件下產生的各種細胞效應和相關分子變化進行檢測。
　　結果:MC-LR染毒α4過表達的HL7702后;PP2A活性受到顯著抑制;PP2A亞基蛋白水平和PP2A/C亞基的翻譯后修飾水平受到影響，如PP2A/C亞基表達上調，PP2A/C亞基Y307位點磷酸化水平升高，PP2A/C亞基L309位點甲基化水平降低;PP2A/C亞基和α4的結合以及

6、PP2A/C亞基和PP2A/A亞基的結合均顯著下降;PP2A活性受到抑制的同時，p-ERK(T202/Y204)，p-JNK(T183/Y185)和p-P38(T180/Y182)磷酸化水平顯著上升，表明三條MAPK通路同時被激活;細胞內微絲，微管和中間纖維形態(tài)和分布沒有發(fā)生變化，細胞骨架結構穩(wěn)定，而骨架相關蛋白VASP(S157)和Ezrin(T567)磷酸化水平上調，VASP(S239)磷酸化水平下調。
　　結論:α4過表達后

7、，MC-LR仍然抑制了HL7702細胞的PP2A活性，其作用方式可能是改變PP2A/C亞基蛋白水平及其翻譯后修飾水平，改變PP2A/C亞基和α4的結合以及PP2A/C亞基和PP2A/A亞基的結合;與未過表達α4的HL7702細胞類似，ERK1/2，P38和JNK三條通路依然被激活;α4的過表達在一定程度上拮抗了MC-LR對骨架的破壞作用，與骨架相關蛋白VASP(S157)，VASP(S239)和Ezrin(T567)的磷酸化水平改變有關