甘油脫氫酶與輔酶I的共固定化研究.pdf

1、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD/NADH作為一類重要的輔酶，協(xié)助多種氧化還原酶催化細(xì)胞內(nèi)包括糖酵解、細(xì)胞呼吸等途徑的重要反應(yīng)。NAD(H)價(jià)格昂貴，易溶于水，不穩(wěn)定，且回收難度大，成為限制氧化還原酶大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的“瓶頸”。本文嘗試將共固定化技術(shù)與輔酶酶法再生結(jié)合，拓展氧化還原酶的工業(yè)應(yīng)用。
　　本課題以輔酶和甘油脫氧酶(GDH)為研究對象，通過海藻酸修飾、環(huán)氧修飾、戊二醛交聯(lián)、羰二亞胺活化等方法將輔酶固定在殼聚糖、納米二氧化硅或碳

2、納米管載體上，選取較優(yōu)載體及方法進(jìn)行固定化條件優(yōu)化;利用NAD+與GDH的親和吸附，嘗試NAD+與GDH的共固定化，并對共固定化條件進(jìn)行優(yōu)化;探討輔酶、甘油與甘油脫氫酶的作用機(jī)制，以其提出依賴輔酶的氧化還原酶催化底物的新機(jī)理。所研究的具體內(nèi)容和得到的主要結(jié)果如下:
　　1.考察殼聚糖、納米二氧化硅、碳納米管三種載體在不同修飾策略、不同初始輔酶濃度、pH、溫度、離子濃度和混合程度下與輔酶固定化的效果。使用殼聚糖為載體，利用海藻酸修飾

3、法，固定化輔酶的有效輔酶利用率達(dá)到60％以上，高于使用碳納米管為載體，利用羰二亞胺活化法固定化輔酶的有效輔酶利用率40％;羰二亞胺活化碳納米管對輔酶固定化量最大，使用90mg載體對22.5μmol輔酶進(jìn)行固定化，對還原性輔酶NADH固定化量達(dá)到約0.15mg·mg-1，對氧化性輔酶NAD+的固定化量達(dá)到約0.075mg·mg-1。
　　2.進(jìn)一步優(yōu)化固定有輔酶NAD+的殼聚糖、納米二氧化硅、碳納米管載體對甘油脫氫酶的親和固定化條件

4、。載有輔酶的碳納米管、殼聚糖微球和納米二氧化硅對GDH的固定化能力分別達(dá)到0.4g·g-1、0.1g·g-1、0.24mg·g-1。以殼聚糖為載體，利用海藻酸修飾NAD+法酶活力回收率達(dá)到3.6％;以碳納米管為載體，利用EDAC活化法酶活力回收率達(dá)到2.3％;以納米二氧化硅為載體，利用環(huán)氧修飾法，酶活力回收率僅為0.28％;其中海藻酸修飾法有較好的應(yīng)用前景。
　　3.通過對固定化輔酶與GDH親和結(jié)合催化底物甘油的靜態(tài)反應(yīng)過程中游離