氯通道ClC-7對牙囊細胞生物學特性影響的體外研究.pdf

1、電壓門控氯離子ClC家族成員在不同的生物類群中均有分布，并具有不同的生物學作用，如穩(wěn)定膜電壓、離子轉(zhuǎn)運和細胞器酸化等。ClC家族成員的重要性表現(xiàn)在某些氯離子通道基因的缺陷能導致遺傳性疾病的發(fā)生，如:先天性肌強直、Dent's病、骨硬化癥、原發(fā)性癲癇等。ClC家族包括三個亞類，共有9個家族成員，它們分別是ClC-1～7，ClC-Ka，ClC-Kb。ClC家族的第三支包括ClC-6和ClC-7，它們在許多不同類型的組織上都有表達，發(fā)揮著調(diào)節(jié)

2、胞內(nèi)細胞器囊泡pH值的作用。ClC-7是這個離子通道家族中表達最廣泛的成員之一，存在于晚期胞內(nèi)體、溶酶體和破骨細胞的皺褶緣膜中。人類ClC-7是由CLCN7基因編碼的，其功能異常影響破骨細胞介導的細胞外酸化作用，導致骨無機物的溶解障礙和一系列的臨床癥狀。
　　在本課題組前期的臨床和基礎研究中，發(fā)現(xiàn)牙的發(fā)育和ClC-7分子密切相關。一方面，CLCN7基因突變所引起的骨硬化癥患者可出現(xiàn)牙根發(fā)育不全及牙萌出受阻，部分牙有釉質(zhì)發(fā)育不全等異

3、常表現(xiàn);另一方面，CLC-7蛋白在小鼠牙胚發(fā)育的各個階段均有表達。據(jù)此推測ClC-7在牙發(fā)育和萌出中可能起著重要的作用。牙囊起源于外胚間充質(zhì)，是包繞在成釉器周圍和牙乳頭底部的呈囊狀排列的結締組織，其在牙齒萌出后期形成牙骨質(zhì)、牙周膜和固有牙槽骨。牙囊是牙萌出的必需條件之一，其在組織、細胞和分子多個水平上調(diào)控牙齒的萌出。
　　目的：
　　基于牙囊細胞在牙發(fā)育和萌出中的重要地位，為了驗證ClC-7在牙萌出中發(fā)揮重要功能的假說，本實

4、驗采用小鼠牙囊細胞(Dental Follicle Cells，DFCs)為體外實驗模型;首先探索小鼠牙囊細胞體外分離培養(yǎng)的合適方法，其次檢測ClC-7在DFCs的表達情況，并通過構建慢病毒shRNA載體干擾DFCs中ClC-7的表達，建立ClC-7缺陷的小鼠牙囊細胞模型，觀察ClC-7表達降低后相關基因的變化;在體外模擬成骨細胞和破骨前體細胞的相互作用，建立DFCs/MNCs（骨髓單核細胞）直接共培養(yǎng)體系，檢測DFCs中ClC-7表達

5、降低后對形成破骨細胞分化和功能的影響;通過采用人工成熟配方的礦化誘導液和模擬天然環(huán)境的牙本質(zhì)浸提液，分別對DFCs進行誘導，檢測兩種誘導液對DFCs成骨/成牙本質(zhì)/成牙骨質(zhì)分化中相關基因表達的影響，檢測DFCs中ClC-7表達降低后對成骨/成牙本質(zhì)/成牙骨質(zhì)分化中相關基因表達和對礦化結節(jié)形成能力的影響。
　　方法:
　　實驗一:采用出生后3～5天的仔鼠，二次酶消化法分離牙囊細胞進行原代培養(yǎng)，觀察各代牙囊細胞生長狀態(tài)和特點，通

6、過免疫細胞化學染色法檢測波形蛋白和角蛋白在所分離細胞的表達情況，鑒定細胞來源。
　　實驗二:構建慢病毒Clcn7-shRNA載體并體外轉(zhuǎn)染DFCs，qRT-PCR檢測其對ClC-7表達水平的干擾效果，并且檢測ClC-7沉默后對DFCs破骨和成骨等相關功能分子表達水平變化的影響，免疫細胞化學染色法檢測CLC-7在DFCs的表達情況。
　　實驗三:建立DFCs/MNCs共培養(yǎng)體系，通過TRAP染色和牙片吸收實驗，即分別計數(shù)形成多

7、核破骨樣細胞的數(shù)目、牙片上形成吸收陷窩的數(shù)目和面積，檢測降低DFCs的ClC-7表達水平后對共培養(yǎng)體系中破骨細胞分化和功能的影響。
　　實驗四:采用礦化誘導液和牙本質(zhì)浸提液對DFCs進行誘導，qRT-PCR檢測兩種誘導液對DFCs成骨/成牙本質(zhì)/成牙骨質(zhì)分化相關基因表達的影響，檢測降低DFCs ClC-7表達水平后對以上基因表達水平的影響，茜素紅染色檢測礦化誘導液在降低DFCs的ClC-7表達水平后對其礦化結節(jié)形成能力的影響。

8、r>　　結果:
　　1.采用二次酶消化法分離培養(yǎng)小鼠牙囊細胞，24小時后見散在細胞集落生成。細胞呈放射狀或漩渦狀生長，為典型成纖維細胞表現(xiàn)。3～5天細胞集落融合，鋪滿板底。細胞呈現(xiàn)為多突起的梭形細胞和多角形細胞兩種細胞形態(tài)混雜生長，兩種細胞群體之間界限不清。體外培養(yǎng)3～5天細胞生長接近融合，傳代12h后細胞恢復形態(tài)貼壁生長，大部分呈梭形，多角形細胞比例減少。第三代細胞生長速度最快，2～3天細胞數(shù)量倍增，細胞大小較為一致，胞體較豐滿

9、，立體感強，細胞呈多形型，部分細胞呈樹突型或水滴型，多角形細胞基本消失。第四代細胞生長速度明顯下降，細胞表面積變大，形態(tài)異型性明顯，胞體趨于扁平，含2個胞核的細胞增多。第五代細胞生長接近停滯，表面積和形態(tài)變化、細胞間差異更為明顯。免疫細胞化學染色顯示分離培養(yǎng)細胞為波形蛋白VIM呈陽性表達，角蛋白CK呈陰性表達。
　　2.慢病毒轉(zhuǎn)染DFCs72h后，熒光顯微鏡下大部分的細胞可見綠色GFP熒光，qRT-PCR結果顯示轉(zhuǎn)染Clcn7-s

10、hRNA慢病毒載體能顯著下調(diào)ClC-7在DFC中的表達水平。進一步通過qRT-PCR檢測成骨相關功能分子Opg、Bsp、Opn、Oc、Alp、Bmp2、Col1釉質(zhì)和牙本質(zhì)的基質(zhì)蛋白分子Dspp、Dmp1、Amelogenin、Enamelin和成牙骨質(zhì)細胞標志分子Cap在DFCs中mRNA表達水平，結果顯示Opg、Opn、Alp、Cap、Rank、Ctsk、M-csf、 Rankl、Runx2和Tfgb1在DFCs中的表達較高，其它分

11、子Dspp、Dmp1、Amelogenin、Enamelin、Oc、Bsp、Bmp2、Trap在DFCs中幾乎不表達或痕量表達。和negative-shRNA轉(zhuǎn)染組相比，Clcn7-shRNA轉(zhuǎn)染組Opg發(fā)生上調(diào)，Opn、Alp、Cap、Rankl發(fā)生下調(diào)并具有統(tǒng)計學意義，而Rank、Ctsk、M-csf和Tfgb1有上調(diào)趨勢但無統(tǒng)計學差異。在蛋白表達水平方面，免疫細胞化學染色法結果表明CLC-7在DFCs中呈陽性表達。
　　3.

12、DFCs/MNCs共培養(yǎng)期間可見到MNCs貼壁聚集成結節(jié)樣結構，DFCs在鏡下呈類圓形且較為通透多突觸的神經(jīng)元樣細胞，MNCs圍繞DFC并聚集在其周圍。DFCs/MNCs共培養(yǎng)7天后能看到眾多TRAP陽性細胞，其中有一部分為多核細胞。共培養(yǎng)14天后掃描電鏡下能看到牙片上有散在的吸收陷窩。TRAP染色計數(shù)Clcn7-shRNA組的多核TRAP陽性細胞數(shù)目少于negative-shRNA組和空白對照組，negative-shRNA組和空白對

13、照組之間無統(tǒng)計學差異。牙片吸收實驗Clcn7-shRNA組的每視野牙片吸收陷窩數(shù)目少于negative-shRNA組空白對照組，Clcn7-shRNA組的平均吸收陷窩面積小于negative-shRNA組和空白對照組，negative-shRNA組和空白對照組之間無統(tǒng)計學差異。
　　4.采用礦化誘導液對DFCs進行誘導3天，qRT-PCR檢測結果顯示成骨分化相關基因Bsp、Opn、Alp、Coll，成牙骨質(zhì)分化相關基因Cap和重要

14、信號通路分子Tgfb1的mRNA水平均發(fā)生了明顯的上調(diào)，其中Bsp、Opn和Cap的上調(diào)幅度達數(shù)十倍甚至數(shù)百倍;采用Cln7-shRNA慢病毒載體降低DFCs中Clcn7的表達水平，礦化誘導液誘導3天，Bsp、Alp、Col1和Tgfb1的mRNA水平均發(fā)生了明顯的上調(diào)。采用慢病毒載體降低DFCs中Clcn7的表達水平，礦化誘導液誘導7、14、21天，茜素紅染色和茜素紅溶解定量實驗顯示Clcn7抑制組和對照組形成礦化結節(jié)的能力無差異。采

15、用牙本質(zhì)浸提液對DFCs進行誘導3天，qRT-PCR檢測結果顯示成骨分化相關基因Bsp、Opn、Alp、Col1和重要信號通路分子Tgfb1的mRNA水平均發(fā)生了明顯的上調(diào)，其中Bsp、Opn的上調(diào)幅度達百倍以上;采用Clcn7-shRNA慢病毒載體降低DFCs中Clcn7的表達水平后進行牙本質(zhì)浸提液誘導3天，所檢測基因分子的mRNA表達水平均發(fā)生不同程度的降低，其中成骨分化相關基因Bsp、Alp、Opn和重要信號通路分子Tgfb1的改

16、變較顯著。
　　結論:
　　1.采用二次酶消化法進行小鼠牙囊細胞原代培養(yǎng)可在短時間內(nèi)獲得較多的細胞，操作簡便且成功率高，是一種較理想的小鼠牙囊細胞培養(yǎng)方法。免疫細胞化學染色結果證明分離的細胞為間充質(zhì)來源，結合取材部位，說明分離所得細胞為DFCs。應選用狀態(tài)最佳的第三代小鼠牙囊細胞進行各類實驗。
　　2.ClC-7在DFCs中有豐富的表達。DFCs中ClC-7表達水平的降低導致成骨相關功能分子和RANK-RANKL-OP

17、G信號軸表達水平的改變，提示DFCs的功能可能與成骨細胞相似，ClC-7在DFCs中可能通過成骨途徑及RANK-RANKL-OPG信號軸發(fā)揮作用。
　　3.DFCs/MNCs共培養(yǎng)體系能模擬DFCs在牙萌出過程的募集和誘導作用，促進MNCs分化為OCLs，降低DFCs的ClC-7表達水平導致OCLs數(shù)目減少及其骨質(zhì)吸收功能降低。
　　4.礦化誘導液能誘導DFCs向成骨/成牙骨質(zhì)向分化，而牙本質(zhì)浸提液僅能誘導DFCs向成骨方向