壇紫菜基因組結(jié)構(gòu)特征及紅毛菜功能基因組特性分析.pdf

1、紅毛菜科物種是紅藻門的代表物種之一，包括具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大型紅藻紫菜和海水紅毛菜，其中壇紫菜是我國(guó)東南沿海特有的海洋經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖作物，占我國(guó)紫菜栽培總產(chǎn)量的75％。海水紅毛菜含有大量高度不飽和脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)，可達(dá)藻體脂肪酸含量的50％左右，是已報(bào)道的EPA含量最高的藻類。同時(shí)這兩種物種位于相同的潮間帶位置，是研究藻類適應(yīng)各種逆境環(huán)境相關(guān)分子機(jī)制的理想物種。目前關(guān)于它們的細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)等都得到了廣泛的研究，但是對(duì)基因組、功能基

2、因組信息及相關(guān)的進(jìn)化關(guān)系的了解仍然不夠全面，對(duì)于了解其真正的遺傳特性及其適應(yīng)潮間帶逆境的機(jī)制仍然缺乏系統(tǒng)的研究。本論文通過對(duì)壇紫菜基因組及功能基因組的研究，進(jìn)一步了解壇紫菜基因組的結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)通過對(duì)海水紅毛菜轉(zhuǎn)錄組及質(zhì)體基因組特性的研究，推測(cè)了海水紅毛菜EPA的合成途徑，解析了紅藻門物種的進(jìn)化關(guān)系和分歧時(shí)間。
　　本論文主要包括以下幾個(gè)內(nèi)容:利用Hiseq2000技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì)壇紫菜基因組特征進(jìn)行初步分析和認(rèn)識(shí);利用單

3、分子測(cè)序技術(shù)對(duì)壇紫菜不同發(fā)育時(shí)期和脅迫處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析;利用Hiseq2000技術(shù)對(duì)海水紅毛菜多個(gè)脅迫處理下的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，探索其EPA的合成途徑;同時(shí)也利用二代測(cè)序技術(shù)結(jié)合Sanger測(cè)序方法獲得了海水紅毛菜完整的質(zhì)體基因組。
　　主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　(1)壇紫菜全基因組大小的預(yù)估和框架圖的繪制
　　本研究通過獲得壇紫菜高質(zhì)量的細(xì)胞核，然后利用流式細(xì)胞技術(shù)估算壇紫菜的核基因組大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果估算

4、出的壇紫菜核基因組的大小為117.84±11.22Mb。然后采取全基因組掃描測(cè)序的方法，對(duì)壇紫菜的基因組進(jìn)行了從頭測(cè)序、組裝。在壇紫菜基因組組裝過程中，利用生物信息學(xué)手段，去除壇紫菜基因組中高拷貝的細(xì)胞器DNA和外源微生物的DNA，得到的無污染的壇紫菜基因組，拼接的結(jié)果為:contigN50為10，527bp，contig N90為2，625bp，基因組大小為29.8Mb。其平均GC含量為65.85％?？偟陌?71個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，36

5、0個(gè)DNA轉(zhuǎn)座子。用軟件預(yù)測(cè)基因組中的SSR序列，共獲得11，253個(gè)SSR，包括144種基序。從整個(gè)重復(fù)序列的組成來看，高GC占有優(yōu)勢(shì)。
　　(2)利用單分子測(cè)序技術(shù)分析壇紫菜轉(zhuǎn)錄組
　　利用單分子測(cè)序技術(shù)對(duì)不同世代和不同脅迫處理?xiàng)l件下的壇紫菜混合樣品進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序，其中高質(zhì)量的consensus isoform17，383條，平均長(zhǎng)度為1.339bp，平均測(cè)序深度12X。對(duì)其基因內(nèi)容的分析，發(fā)現(xiàn)大量逆境耐受相關(guān)候選基

6、因。發(fā)現(xiàn)了在壇紫菜中存在12條類萌蛋白，對(duì)其進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其單獨(dú)聚為一大支，和現(xiàn)有的五類類萌蛋白和真萌蛋白互為姐妹群，推測(cè)壇紫菜中也存在類似高等植物響應(yīng)干旱脅迫的機(jī)制。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)壇紫菜不僅可以通過類胡蘿卜素的合成途徑來消除過剩的光能，而且還可能存在響應(yīng)高光輻照的葉黃素循環(huán)途徑。此外，結(jié)合基因組的數(shù)據(jù)分析共獲得91，940種基因的可變剪接位點(diǎn)，3，274個(gè)基因的可變接形式。通過分析發(fā)現(xiàn)壇紫菜的轉(zhuǎn)錄組中共存在SC35、RS40、RS

7、31和RS2Z33的四種類型的可變剪接因子，其中SC35和RS40分別具有3種和2種可變剪接形式，推測(cè)其可以通過增加轉(zhuǎn)錄本的復(fù)雜度來幫助壇紫菜適應(yīng)各種環(huán)境脅迫。
　　(3)海水紅毛菜轉(zhuǎn)錄組特性分析
　　利用Hieseq2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)海水紅毛菜的混合樣品的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析，總共獲得了71，069，330條raw reads，總的堿基數(shù)量約為7.11G，其平均的GC含量為63.99％。經(jīng)過拼接總共獲得41，935條unig

8、ene，平均長(zhǎng)度為533bp，N50為645bp。海水紅毛菜的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中含有多種類型的多不飽和脂肪酸去飽和酶，推測(cè)海水紅毛菜中EPA含量較高可能是由于存在多種EPA的合成途徑:即經(jīng)典的n6途徑、n3途徑和連通的n6、n3途徑和由其他不飽和脂肪酸酶介導(dǎo)的旁路。海水紅毛菜中存在著酵母類型、動(dòng)物P38、JNK和ERK5類型的MAPK信號(hào)系統(tǒng)，能響應(yīng)多種應(yīng)激因子，可能對(duì)其適應(yīng)潮間帶苛刻環(huán)境具有重要的作用。通過對(duì)海水紅毛菜轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)

9、的分析，構(gòu)建了海水紅毛菜中EPA的合成途徑，為海水紅毛菜完整的脂質(zhì)合成特別是多不飽和脂肪酸合成的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　(4)海水紅毛菜完整的質(zhì)體基因組特性分析
　　海水紅毛菜的質(zhì)體基因組是一個(gè)典型的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，總長(zhǎng)度為196，913bp，GC含量為33.5％。整個(gè)結(jié)構(gòu)被兩個(gè)同向的、不相同的重復(fù)區(qū)域（約4.8kb）區(qū)分為151kb的大拷貝區(qū)和36Kb的小拷貝區(qū)。兩個(gè)重復(fù)序列主要編碼16s rRNA,23srRNA，5s rR

10、NA和兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（trnI，trnA）。整個(gè)質(zhì)體基因組包括207個(gè)蛋白編碼基因，37個(gè)tRNAs和6個(gè)rRNAs，分別占據(jù)總序列的73.01％，2.07％和4.88％，總的編碼區(qū)域占據(jù)總序列的79.96％。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)14個(gè)重疊基因(psbC-psbD,atpD-atpF,ycf24-ycf16，rps19-rpl2,rpl23-rpl4，carA-ORF238和rpl24-rpl14）。這些結(jié)構(gòu)表明海水紅毛菜是一個(gè)高度緊湊和高編碼能