甜菜M14品系花期特異表達(dá)基因cDNA文庫的構(gòu)建及篩選.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室的郭德棟教授通過遠(yuǎn)緣雜交方法獲得了甜菜無融合生殖單體附加系M14品系(VV+1C，2n=18+1)，以下簡(jiǎn)稱甜菜M14品系。它的染色體組成是栽培甜菜(Beta vulgaris L．，VV，2n=18)染色體組附加了白花甜菜(Beta corollifloraZoss，CCCC，2n=36)的第9號(hào)染色體。經(jīng)過連續(xù)四年的胚胎學(xué)鑒定和細(xì)胞遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)，這條附加的染色體平均傳遞率為96.5％。甜菜M14品系是極其難得的克隆無融合生殖基

2、因的材料。 本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)在甜菜M14品系無融合生殖發(fā)育表現(xiàn)出的三個(gè)特殊的關(guān)鍵時(shí)期獲得了甜菜M14品系特異表達(dá)基因的3個(gè)抑制消減EST庫和1個(gè)差異顯示EST庫。在此工作基礎(chǔ)之上，本實(shí)驗(yàn)利用與EST庫取樣時(shí)期一致的總RNA構(gòu)建了甜菜M14品系花期特異表達(dá)基因的3個(gè)ZAP表達(dá)載體cDNA文庫。對(duì)庫容量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示每個(gè)初始文庫滴度均達(dá)到1.25×10<'6> pfu/mL以上，插入片段長(zhǎng)度主要集中在400～3000bp，達(dá)到覆蓋遺

3、傳信息的標(biāo)準(zhǔn)。從抑制消減EST庫中隨機(jī)挑選了3個(gè)EST作為探針，對(duì)與之同一時(shí)期的cDNA文庫Ⅰ進(jìn)行篩選，得到了3個(gè)陽性單克隆，以噬菌體形式保存并已進(jìn)行了測(cè)序。篩選獲得的cDNA片段分別命名為Me-c84(797bp)、Me-c86(1 182bp)和Me-c264(測(cè)序中)。利用RACE技術(shù)對(duì)Me-c862生行了5′末端擴(kuò)增，將1％瓊脂糖凝膠上檢測(cè)的特異性條帶進(jìn)行回收測(cè)序。通過核酸序列分析軟件拼接Me-c86及其5′末端序列獲得全長(zhǎng)cD