空心蓮子草幾丁質(zhì)酶分離純化及其抗逆相關(guān)性研究.pdf

1、莧科蓮子屬多年生草本植物空心蓮子草(Alternathera philoxeroides)因其強抗逆性而迅速蔓延，成為有害雜草，嚴重破壞生態(tài)環(huán)境，影響農(nóng)、牧、漁生產(chǎn)。對該雜草的治理一直是各國政府的工作重點。但雖曾大力推行化學(xué)和生物防治，卻沒有收到預(yù)期效果，危害仍很嚴重。 植物病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related protein，PRs)是植物體內(nèi)的一類功能蛋白。植物病原物及各種環(huán)境脅迫因子均會引起病程相關(guān)蛋白增

2、加，進而提高植物防御能力。大量研究表明，幾丁質(zhì)酶(Chitinase)作為重要的病程相關(guān)蛋白，參與不同植物的多種脅迫反應(yīng)。因此本研究將(一)觀察不同脅迫條件下，空心蓮子草內(nèi)幾丁質(zhì)酶的變化規(guī)律；(二)提取分離空心蓮子草幾丁質(zhì)酶；(三)研究空心蓮子草幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)，以研究該植物的抗逆機制，掌握其抗逆薄弱環(huán)節(jié)，為其有效防治提供新的思路，為化學(xué)和生物防治的最佳時機選擇提供理論依據(jù)。研究結(jié)果如下： 一、不同脅迫條件下，空心蓮子草幾丁質(zhì)

3、酶有不同的變化規(guī)律。 不同濃度殼聚糖、NaCl、乙烯利處理及機械損傷均能引起空心蓮子草葉片幾丁質(zhì)酶活性增加。其中植物對乙烯利的反應(yīng)最為迅速，如0.1 mg·ml-1及0.2mg·ml-1乙烯利處理1天后，幾丁質(zhì)酶活力就顯著高于對照組(p<0.01)，在第2、3天時，酶活力仍很高(p<0.01)，到第4天時，才回落到對照水平；其次，空心蓮子草對殼聚糖的反應(yīng)也較快，0.1％殼聚糖處理后第2～5天、0.2％殼聚糖處理后第2～4天及0.

4、4％殼聚糖處理后第2～3天后，葉片幾丁質(zhì)酶活力均顯著增加(p<0.05)；同樣，機械損傷3天后，空心蓮子草葉片中的幾丁質(zhì)酶比活力比對照組增加2倍多(p<0.01)。相比之下，空心蓮子草對鹽脅迫較不敏感，只有1％NaCl處理第8天后，幾丁質(zhì)酶活力才明顯增加(p<0.01)。 二、空心蓮子草幾丁質(zhì)酶具特殊的酶學(xué)性質(zhì)。 空心蓮子草通過研磨、(NH4)2SO4分級沉淀法(確定40％～60％為最佳飽和硫酸銨濃度區(qū)間)、Sephad

5、ex G-75凝膠層析、DEAE-Sepharose Fast flow離子交換層析及Sephadex G-100凝膠層析等純化步驟，分離出幾丁質(zhì)酶。經(jīng)SDS-PAGE檢測為單一蛋白條帶，測定分子量約為45kDa。純酶比活力為39.77U·mg-1，純化倍數(shù)為26.17。該幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度60℃，最適反應(yīng)pH為5.7，在pH4.0～8.0時比較穩(wěn)定。當pH小于4.0和大于8.0時酶活力喪失50％以上，在pH2.0和10.0處無活力，