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文檔簡(jiǎn)介
1、幾丁質(zhì)酶基因作為昆蟲(chóng)中重要的一種酶類基因,參與生物體生長(zhǎng)發(fā)育期間的蛻皮及新表皮的形成過(guò)程。RNAi(RNA interence)作為一種重要的基因沉默方式,它在研究生物基因功能和防治方面得到了廣泛的應(yīng)用和研究。本文對(duì)分月扇舟蛾的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了克隆,并根據(jù)其基因序列進(jìn)行了它的生物信息學(xué)分析。以山新楊的葉片作為外植體,構(gòu)建了幾丁質(zhì)酶基因Chi干涉表達(dá)載體pBI121-Chif-intron-Chir,利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)山新楊進(jìn)行遺傳
2、轉(zhuǎn)化,并對(duì)轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行了篩選、PCR檢測(cè),Chi基因的表達(dá)量的檢測(cè),并對(duì)其進(jìn)行了抗蟲(chóng)性的研究,獲得了如下主要結(jié)果:
1、采用STE法提取分月扇舟蛾的RNA,并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,利用PCR技術(shù)對(duì)分月扇舟蛾的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了克隆,并根據(jù)其測(cè)序的序列對(duì)其進(jìn)行基因的序列分析,了解它的氨基酸組成及含量,對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行了保守區(qū)和神經(jīng)肽的預(yù)測(cè),并與其氨基酸序列相似的27種幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了多序列對(duì)比并作出進(jìn)化樹(shù),構(gòu)建出幾丁質(zhì)酶基
3、因的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。
2、提取分月扇舟蛾的基因組DNA,利用PCR技術(shù)克隆得到分月扇舟蛾神經(jīng)肽PBAN基因的第三個(gè)內(nèi)含子部分序列。以分月扇舟蛾的RNA為模版,利用PCR技術(shù)克隆得到Chi基因的保守區(qū)部分序列,然后將其正向和反向與PBAN基因內(nèi)含子基因片段通過(guò)酶切連接轉(zhuǎn)化等一系列的操作構(gòu)建到中間載體pUC19上,并以卡納霉素作為篩選基因抗生素的干涉表達(dá)載體pBI121-Chif-intron-Chir。最后將重組載體成功的導(dǎo)
4、入到農(nóng)桿菌EHA105中。
3、以山新楊作為外植體,對(duì)其進(jìn)行抗生素的敏感性測(cè)定,并建立了最佳的遺傳轉(zhuǎn)化體系,通過(guò)選擇培養(yǎng)獲得了具有目的片段的轉(zhuǎn)基因山新楊植株,并通過(guò)PCR技術(shù)最終確定獲得了7株具有目的片段的轉(zhuǎn)基因山新楊植株,通過(guò)熒光定量PCR確定了7種轉(zhuǎn)基因山新楊株系中表達(dá)量T4>T7>T2>T6>T5>T3>T1.
4、對(duì)含有Chi基因的RNAi轉(zhuǎn)基因山新楊進(jìn)行組織培養(yǎng),擴(kuò)大繁殖,飼喂分月扇舟蛾通過(guò)熒光定量PCR發(fā)
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