L03菌株種類鑒定及其幾丁質(zhì)酶分離純化與性質(zhì)研究.pdf

1、幾丁質(zhì)酶可以降解真菌細(xì)胞壁，從而抑制真菌生長(zhǎng)，因此能分泌幾丁質(zhì)酶的微生物可以作為生防菌加以研究利用。由作者篩選的L03菌株能分泌幾丁質(zhì)酶，其活性為0.702U/mL。經(jīng)16SrDNA序列測(cè)序與Blast比對(duì)，該菌株與中華根瘤菌屬等屬的細(xì)菌相似性達(dá)99％；與近似種比較試驗(yàn)顯示，L03菌株的生理生化性狀與中華根瘤菌屬細(xì)菌相似，認(rèn)為L(zhǎng)03菌株為中華根瘤菌屬細(xì)菌(Sinorhizobiumsp.)。 L03菌株分泌的幾丁質(zhì)酶能夠用90

2、％飽和濃度的硫酸銨沉淀，沉淀物經(jīng)脫鹽后得到粗酶液。粗酶液先進(jìn)行Phenyl-Sepharose6 Fast Flow疏水層析，分離出7個(gè)蛋白峰，其中僅峰4具幾丁質(zhì)酶活性；將峰4蛋白再經(jīng)DEAE-Sephrose Fast Flow離子交換層析得到7個(gè)蛋白峰，其中峰4-5蛋白能降解幾丁質(zhì)；峰4-5蛋白經(jīng)Sephadex G-75凝膠過(guò)濾后有3個(gè)峰，峰4-5-1具有酶活性。因此峰1蛋白為L(zhǎng)03菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶蛋白。收集幾丁質(zhì)酶蛋白，對(duì)其進(jìn)

3、行SDS-PAGE電泳，得出該蛋白的分子量為41.3kDa。 L03菌株幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)的最適溫度為40~45℃，水解反應(yīng)體系的最適pH為6。幾丁質(zhì)酶在一定環(huán)境條件下的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明，酶液在40℃以下溫度處理1h，酶解性質(zhì)穩(wěn)定，各處理酶活性基本相似，但50℃處理1h后活性明顯下降；酶液在pH5~8條件下處理1h，活性基本不變。幾丁質(zhì)酶對(duì)一些金屬離子敏感，表現(xiàn)在反應(yīng)體系中加入金屬離子后酶活性顯著降低，如Ca2+、2ri2+

4、、Cu2+、Fe3+。但另一些金屬離子，對(duì)酶活性顯著提高，如Mg2+、Ba2+等。 L03菌株幾丁質(zhì)酶對(duì)多種重要植物病原真菌的細(xì)胞壁有明顯的降解作用，如水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、水稻惡苗病菌(Fusarium moniliforme)、小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、

5、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、蘋(píng)果炭疽病菌(Glomerella cingulata)等。用酶液處理病菌后，一般能使菌絲出現(xiàn)細(xì)胞壁模糊、顏色變淡現(xiàn)象，甚至還能導(dǎo)致菌絲細(xì)胞畸形或菌絲完全崩解。 對(duì)L03菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化。用均勻設(shè)計(jì)法在5個(gè)因素6個(gè)水平上設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPS軟件分析，得出最佳的培養(yǎng)方法