采用AFLP分子標(biāo)記和分子生物學(xué)方法對(duì)資源植物的評(píng)價(jià).pdf

1、中國資源植物豐富，蘊(yùn)藏著優(yōu)異的基因資源，開發(fā)和利用這些優(yōu)異資源是植物學(xué)研究的重要課題。本文面向國家重大需求選擇兩種資源植物一羊草(Leymuschinensis(Trin.)Tzvel)和向日葵(Heliathus annuus L.)，采用分子標(biāo)記技術(shù)和分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)和研究，以期為資源利用提供依據(jù)。由于兩種植物本身的差別和采用的研究方法各異，故分別論述。
　　 羊草，隸屬禾本科賴草屬，是歐亞大陸草原區(qū)東部重要建群種

2、之一。羊草是牧草之王，是我國比較有優(yōu)勢的戰(zhàn)略性生物資源，對(duì)我國北方畜牧業(yè)的發(fā)展以及生態(tài)環(huán)境的保育均具有重要意義。近年來，由于缺乏科學(xué)管理、過度放牧等不利影響，加之羊草本身固有的“三低”問題(即抽穗率低、結(jié)實(shí)率低、發(fā)芽率低)已對(duì)羊草生物多樣性維持構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，限制了我國人工草地建設(shè)和天然草地的改良及沙化治理的步伐。因此，如何通過形態(tài)調(diào)查結(jié)合生物技術(shù)手段評(píng)價(jià)羊草遺傳多樣性為建立核心種質(zhì)及改良羊草、快速評(píng)價(jià)和創(chuàng)造新的種質(zhì)、如何加快育種進(jìn)程

3、便成為當(dāng)前亟待解決的問題。本文圍繞這些問題開展了系統(tǒng)的研究并取得如下結(jié)果：
　　 1.對(duì)羊草的形態(tài)調(diào)查和AFLP分析，表明羊草是一種形態(tài)變異較大但是遺傳變異較小的物種。兩種生態(tài)型的表現(xiàn)顯著差異，其中灰綠生態(tài)型羊草比黃綠生態(tài)型差異大。羊草遺傳多樣性與包括長期的栽培馴化、地理分布有很大的相關(guān)性，地理來源相同的幾乎全部聚到了一組。
　　 2.通過主成分分析和通徑分析，簡化了羊草31個(gè)性狀分析的復(fù)雜性，了解到羊草無性繁殖受好的營

4、養(yǎng)生長促進(jìn)。
　　 3.AFLP分子標(biāo)記技術(shù)在分析羊草遺傳多樣性方面有顯著優(yōu)勢，尤其是對(duì)于羊草這樣多態(tài)性不高的物種是一種非常有效的分析工具。在分析AFLP數(shù)據(jù)時(shí)采用聚類分析和主坐標(biāo)分析相結(jié)合的方法，既兼顧了親緣關(guān)系較近的種質(zhì)之間的關(guān)系調(diào)查也兼顧了親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種質(zhì)之間的關(guān)系調(diào)查。
　　 4.羊草AFLP反應(yīng)，不同引物所獲得的總帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)差別明顯。羊草基因組對(duì)3'端有選擇性堿基TN的所有EcoRI選擇性引物擴(kuò)增效果很

5、差，前人的有關(guān)賴草屬的遺傳研究也支持這一結(jié)果。
　　 向日葵(n=17)，屬于菊科(Compositae)向日葵屬(Heliathus)，向日葵的研究重要領(lǐng)域是向日葵雜種生產(chǎn)，而細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的使用是雜種優(yōu)勢育種的核心。全世界90％以上的向日葵雜交種生產(chǎn)仍然在使用同一個(gè)細(xì)胞質(zhì)類型PET1,玉米遺傳單一給生產(chǎn)帶來的毀滅性打擊仍然令研究者和生產(chǎn)者記憶猶新,因此，尋找更多的細(xì)胞質(zhì)類型仍然是研究者的重要任務(wù)。本研究圍繞一個(gè)新的不育源(

6、G20023)的發(fā)現(xiàn)及鑒定，通過使用不育的G20023的保持系、恢復(fù)系、恢復(fù)的F1代、回交一代之間比較以及與屬于PET1細(xì)胞質(zhì)類型的不育系的相應(yīng)材料進(jìn)行比較，找出與這一新的細(xì)胞質(zhì)類型不育表型有關(guān)的可能差異序列，來探討其不育機(jī)制，得到如下結(jié)果：
　　 1、通過田間雜交試驗(yàn)，證明G20023的保持系有很多(已證實(shí)有24份),目前找到的恢復(fù)系只有一個(gè)，H.maximiliani。G20023不育源作為一種新的細(xì)胞質(zhì)類型可以成為將來雜交

7、育種的候選資源。同時(shí)，我們找到一些表型證據(jù)，除了無花粉之外，G20023與PET1表型的典型不同之處還在于前者的花藥上下均為分離狀態(tài)，而后者花藥的基部聯(lián)合，項(xiàng)部分離。顯然，不同的細(xì)胞質(zhì)類型在解剖結(jié)構(gòu)上可能表現(xiàn)不盡相同。
　　 2、與線粒體基因組特異基因的核酸序列比較，結(jié)果表明，G20023線粒體基因組上沒有orfH522序列，與PET1表現(xiàn)出差異；此外，在基因atp6位點(diǎn)也與PET1不同，而且在該位點(diǎn)也與同屬向日葵ANT1不相同

8、。同時(shí)由于orf873并沒有出現(xiàn)在ANT1中而出現(xiàn)在G20023中，因此我們可以認(rèn)為G20023這一個(gè)新的不育系是與ANT1和PET1不同的細(xì)胞質(zhì)類型。
　　 3、在參考常規(guī)線粒體DNA提取方法的基礎(chǔ)上，我們做了很多改進(jìn)，建立了自己的向日葵線粒體DNA提取方法。該方法更快更簡單，提取的線粒體DNA完全可以用于酶切和雜交。
　　 4、 G20023不育源由于其穩(wěn)定的不育性狀，可以作為培育無花粉彩色向日葵雜交種的親本材料，我