用于藥物安全性評(píng)價(jià)的斑馬魚(yú)生物技術(shù)平臺(tái)建設(shè)研究.pdf

1、第一部分斑馬魚(yú)普通實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖體系的建立
　　 目的：建立普通實(shí)驗(yàn)室條件下的斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)，通過(guò)日常飼養(yǎng)和胚胎繁育初步掌握斑馬魚(yú)生物學(xué)特性，為今后建立斑馬魚(yú)用于藥物安全評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)奠定基礎(chǔ)。方法：利用魚(yú)缸、潛水泵、溫控棒、過(guò)濾器等建立普通斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)，并用配對(duì)產(chǎn)卵和人工受精的方法獲得斑馬魚(yú)胚胎。結(jié)果：建立起了普通實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)，并成功繁育斑馬魚(yú)。結(jié)論：建立的普通實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)具有廉價(jià)、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，

2、為建立斑馬魚(yú)用于藥物安全評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)奠定了基礎(chǔ)，可用于前期一般研究。
　　 第二部分斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育特征及適宜的毒理學(xué)終點(diǎn)分析
　　 目的：觀察斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的全過(guò)程，分析可用于胚胎毒性試驗(yàn)的適宜的毒理學(xué)指標(biāo)。方法：選取健康的性成熟斑馬魚(yú)雌雄配對(duì)產(chǎn)卵，用體式顯微鏡對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程進(jìn)行系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察，并拍攝整個(gè)過(guò)程。結(jié)果：斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育可以大致分成受精卵期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、體節(jié)期、咽部期和孵化期等7個(gè)時(shí)期；建議了

3、一些在胚胎毒性研究中適宜的毒理學(xué)觀察終點(diǎn)。結(jié)論：初步掌握了斑馬魚(yú)的胚胎發(fā)育過(guò)程以及各時(shí)期發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征，確立的部分毒理學(xué)終點(diǎn)具有實(shí)際可行性。
　　 第三部分秋水仙堿對(duì)斑馬魚(yú)肝臟和鰓SOD和Na+-K+-ATPase活性及組織結(jié)構(gòu)的影響
　　 目的：研究不同濃度的秋水仙堿對(duì)斑馬魚(yú)肝臟和鰓組織SOD和Na+-K+-ATPase活性及組織結(jié)構(gòu)的影響，探索以斑馬魚(yú)的某些酶類活性和組織結(jié)構(gòu)變化作為觀測(cè)指標(biāo)進(jìn)行藥物安全性評(píng)價(jià)的試驗(yàn)

4、方法，為建立用于藥物安全評(píng)價(jià)的斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)奠定基礎(chǔ)。方法：在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上將斑馬魚(yú)暴露于秋水仙堿5個(gè)濃度組中進(jìn)行96h急性毒性試驗(yàn)，計(jì)算其半數(shù)致死濃度(LC50)。此外，設(shè)置3個(gè)濃度(0.67、1.70、4.26mg·L-1)，進(jìn)行21d慢性毒性實(shí)驗(yàn)，期間每7天測(cè)定斑馬魚(yú)的肝臟和鰓中的SOD和Na+-K+-ATPase活性。21d染毒結(jié)束，取各組斑馬魚(yú)鰓和肝臟組織進(jìn)行HE染色，觀察秋水仙堿染毒對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果：秋水仙堿對(duì)斑馬魚(yú)的L

5、C50為16.90mg·L-1。隨秋水仙堿濃度增大和染毒時(shí)間延長(zhǎng)，斑馬魚(yú)鰓中SOD和Na+-K+-ATPase活性均顯著受到抑制；肝臟SOD活性增加，Na+-K+-ATPase活性總體呈現(xiàn)抑制趨勢(shì)。病理切片結(jié)果顯示秋水仙堿對(duì)斑馬魚(yú)鰓和肝臟組織有不同程度的損害。結(jié)論：斑馬魚(yú)肝臟和鰓的SOD及Na+-K+-ATPase對(duì)秋水仙堿敏感，可作為觀測(cè)指標(biāo)用于評(píng)價(jià)藥物的毒性。
　　 第四部分秋水仙堿對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中tnf-α和sod-1基

6、因表達(dá)的影響
　　 目的：研究不同濃度秋水仙堿對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中tnf-α和sod-1基因表達(dá)的影響，探索以斑馬魚(yú)胚胎為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以目的基因的mRNA相對(duì)含量為指標(biāo)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)方法。方法：用不同濃度的秋水仙堿(0mg·L-1、10mg·L-1和40mg·L-1)處理斑馬魚(yú)胚胎，收集受精后24h、48h和72h的斑馬魚(yú)胚胎，用RT-PCR方法觀察tnf-α和sod-1基因在不同時(shí)期斑馬魚(yú)胚胎中的表達(dá)情況

7、。結(jié)果：在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，與對(duì)照組相比，各藥物處理組的斑馬魚(yú)胚胎tnf-α基因表達(dá)均受到抑制，并呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)關(guān)系；斑馬魚(yú)胚胎sod-1基因在較低濃度組(10mg·L-1)表達(dá)上調(diào)，而較高濃度組(40mg·L-1)則抑制其表達(dá)。結(jié)論：研究了不同濃度秋水仙堿對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育中tnf-α和sod-1基因表達(dá)的影響，初步建立了以斑馬魚(yú)胚胎為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以目的基因的相對(duì)含量為觀測(cè)指標(biāo)的RT-PCR檢測(cè)方法，為建立用于藥物安全性評(píng)價(jià)的斑馬魚(yú)生物體系平臺(tái)