斑馬魚藥物篩選平臺(tái)用于探索藥物多效性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、心血管疾病是目前在發(fā)達(dá)國家及發(fā)展中國家日趨成為發(fā)病率及死亡率最高的疾病之一，其中冠狀動(dòng)脈性心臟病最為常見，是引起全世界關(guān)注的疾病之一。引發(fā)冠心病的病理生理過程中有多種因素參與和相互作用，如炎癥、免疫等。通過藥物的單一作用常常不能達(dá)到對(duì)疾病的有效的治療目的。
　　 既往對(duì)藥物的傳統(tǒng)理解為“一對(duì)一”的靶向治療更具有敏感性及特異性，也確實(shí)成功應(yīng)用于單一疾病的治療，而隨著疾病種類的增加及復(fù)雜疾病的日益增多，人們開始關(guān)注單一藥物達(dá)到多種治

2、療目的，即使用具有多價(jià)性或多功能藥物。顧名思義，即單一藥物具有多個(gè)作用位點(diǎn)可同時(shí)產(chǎn)生多個(gè)效應(yīng)。較傳統(tǒng)多種藥物聯(lián)合使用的優(yōu)點(diǎn)在于減少了藥物之間相互作用，增加了患者依從性。而發(fā)掘新的藥物效應(yīng)的重要方式之一就是使用已知的藥物數(shù)據(jù)庫實(shí)施篩選，其優(yōu)勢(shì)是這些已知的藥物具有明確的藥物代謝分布，避免了臨床應(yīng)用前的諸多程序。
　　 使用藥物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行藥物篩選首先面臨的問題就是選擇合適的篩選動(dòng)物模型。在最初在研究中使用的藥物篩選模型主要是細(xì)胞及病毒

3、等，他們具有高通量及花費(fèi)少等優(yōu)勢(shì)，但隨著醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展，它們存在未考慮細(xì)胞及組織之間的相互作用等缺點(diǎn)日漸成為限制其發(fā)展的瓶頸。研究者們將焦點(diǎn)轉(zhuǎn)為小型整體動(dòng)物，例如線蟲、果蠅等，而其中最具有優(yōu)勢(shì)是斑馬魚篩選模型。2003年Circulation發(fā)表了DavidJ.Milan等基于斑馬魚藥物篩選模型的研究，通過篩選100多種化合物最終明確了23種化合物對(duì)斑馬魚心率的影響，為臨床用藥研究提供重要線索，同時(shí)為斑馬魚在心血管系統(tǒng)的應(yīng)用開創(chuàng)了新的方

4、向。
　　 在斑馬魚篩選模型發(fā)現(xiàn)藥物多效性研究方面目前尚處于起步階段，而ChunyangWang利用斑馬魚藥物篩選模型發(fā)現(xiàn)，目前主要用于干預(yù)血脂代謝的瑞舒伐他汀鈣可通過抑制血管生成而發(fā)揮抗前列腺腫瘤的作用。我們推測(cè)心血管系統(tǒng)常用藥物應(yīng)存在多種心血管保護(hù)作用，通過斑馬魚篩選平臺(tái)有可能發(fā)現(xiàn)這些藥物存在的多效性。
　　 本研究主要目的一是建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因斑馬魚藥物篩選平臺(tái)；二是通過藥物篩選發(fā)現(xiàn)心血管常用藥物的多效性，并研究新效

5、應(yīng)的作用機(jī)制及途徑。
　　 本研究主要內(nèi)容包括三部分：第一部分，建立穩(wěn)定的斑馬魚藥物篩選平臺(tái)，包括對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化如實(shí)驗(yàn)容器24孔板、48孔板、96孔板孵育斑馬魚胚胎的效果比較，DMSO的濃度等研究內(nèi)容。第二部分，分析心血管常用藥物包括降壓、降脂、抗心律失常等藥物對(duì)斑馬魚心率、血流、血管發(fā)育等的影響，包括使用熒光顯微鏡及相關(guān)軟件觀察并計(jì)算血管生成等內(nèi)容，探索藥物對(duì)血管生成的影響。第三部分，對(duì)篩選出影響血管發(fā)育的藥物，在HUVEC

6、驗(yàn)證藥物效應(yīng)及其機(jī)制。
　　 第一部分、建立轉(zhuǎn)基因斑馬魚藥物篩選平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：建立斑馬魚藥物篩選平臺(tái)，建立轉(zhuǎn)基因斑馬魚藥物篩選的穩(wěn)定流程
　　 方法：1.使用Tg(flk1：EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚魚系，在標(biāo)準(zhǔn)溫度及光照條件下培養(yǎng)，獲取斑馬魚胚胎，并與28.5±0.5℃條件下孵化。2.藥物刺激起始時(shí)間為0hpf，觀察時(shí)間為72h。3.使用含有DMSO的魚卵水(eggwater)配制藥物溶液。4。將斑馬

7、魚胚胎分別放置于24孔板、48孔板及96孔板且以0.1％-4％的DMSO以5個(gè)濃度梯度(0.1％、0.5％、1％、2％、4％)孵育斑馬魚胚胎，每組胚胎20個(gè)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。主要觀測(cè)不同容器及不同濃度媒介對(duì)斑馬魚胚胎造成的死亡或畸形的發(fā)生率。5.比較藥物浸泡0hpf胚胎及受精卵單細(xì)胞期顯微注射藥物至卵黃囊兩種藥物處理方法，使用瑞舒伐他汀作為陽性藥物，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察不同藥物濃度對(duì)斑馬魚血管發(fā)育的影響，初步判定藥物作用于斑馬魚產(chǎn)生效應(yīng)

8、的濃度范圍。6.數(shù)據(jù)處理中計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示，組間差異采用方差分析統(tǒng)計(jì)方法，P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。
　　 結(jié)果：1.72hpf時(shí)96孔板及48孔板中畸形及死亡的胚胎發(fā)生率分別為38.33±1.53％，19，33±1.53％，較24孔板的發(fā)生率(7.00±1.00％)明顯增高，表明24孔板作為實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所較48孔板及96孔板適合孵育斑馬魚胚胎。以eggwater為溶質(zhì)配制的0.5％DMSO作為溶解藥物的媒

9、介對(duì)斑馬魚胚胎的毒性最小。2。使用藥浴方法更容易發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀對(duì)血管生成的抑制作用，且該藥物產(chǎn)生血管抑制作用的濃度范圍是以藥物說明書提供的血藥濃度為基準(zhǔn)的。3.建立了從斑馬魚胚胎產(chǎn)生至藥物效應(yīng)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)流程。
　　 結(jié)論：應(yīng)用24孔板放置胚胎；以0.5％的DMSO溶解藥物，根據(jù)臨床血藥濃度為參照配制的溶液是有效的實(shí)驗(yàn)藥物濃度，使用藥物溶液在實(shí)驗(yàn)體系中浸泡斑馬魚胚胎方法簡(jiǎn)便，可行?？稍跓晒怙@微鏡下直接觀察藥物對(duì)斑馬魚血管發(fā)育的影響

10、。
　　 第二部分、心血管常用藥物對(duì)斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響研究
　　 目的：研究心血管系統(tǒng)常用藥物對(duì)斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響，發(fā)掘藥物潛在的多效性。
　　 方法：將17種常用心血管病藥物參考人體的血藥濃度，使用eggwater將藥物配制為不同濃度的溶液，搜集發(fā)育至0hpf時(shí)相的轉(zhuǎn)基因斑馬魚魚系胚胎，使用6個(gè)不同濃度的藥物溶液浸泡，同時(shí)將0.5％DMSO溶液作為對(duì)照組，在胚胎發(fā)育的24-30小時(shí)，將胚胎使用t

11、ricaine麻醉后，利用甲基纖維素將胚胎固定于玻片上，使用熒光顯微鏡觀察在明場(chǎng)或熒光下觀察藥物對(duì)心率、血流及血管發(fā)育的影響。數(shù)據(jù)處理：計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，在Excel表格中行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的區(qū)別，所有數(shù)據(jù)均采用單尾檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：1.通過在明場(chǎng)下記錄斑馬魚心率，我們發(fā)現(xiàn)在篩選的17種藥物中，多巴胺、腎上腺素處理后斑馬魚的平均心率分別為141.3±1.0

12、01次/分，139.8±0.986次/分，較對(duì)照組(118.9±0.706)次/分增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而普羅帕酮、比索洛爾及美托洛爾則可減慢斑馬魚心率，平均心率分別為89.8±0.853次/分，91.9±1.370次/分、95.8±0.917次/分。2.為簡(jiǎn)單明確了解藥物對(duì)斑馬魚血管發(fā)育的影響，選擇在內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚魚系Tg(flk1：EGFP)，發(fā)現(xiàn)氨氯地平、單硝酸異山梨酯、比索洛爾可促進(jìn)斑馬魚血管發(fā)育，表

13、現(xiàn)為胚胎發(fā)育至26hpf，藥物處理組的胚胎節(jié)間血管生長較快，平均長度分別為0.083±0.002mm、0.103±0.004mm、0.066±0.001mm，較對(duì)照組(0.042±0.001mm)明顯增加，且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而阿托伐他汀鈣、厄貝沙坦、卡維地洛表現(xiàn)為對(duì)節(jié)間血管發(fā)育有抑制作用，節(jié)間血管平均長度分別為0.028±0.000mm、0.034±0.001mm、0.029±0.000mm，較對(duì)照組(0.041±0

14、.001mm)明顯減少。3.噻吩類藥物氯吡格雷及噻氯匹定均可抑制斑馬魚早期血流形成，血管造影顯示造影劑淤滯，集中在注射部位。4.阿托伐他汀鈣作用于胚胎48小時(shí)后可影響斑馬魚血管完整性，主要表現(xiàn)為頭部血管出血，但血管造影未見明顯血管缺失。
　　 結(jié)論：多種藥物可對(duì)斑馬魚心血管系統(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生影響，同時(shí)生物活性表現(xiàn)在斑馬魚與人體相似，顯示斑馬魚可用作藥物篩選的研究模型。
　　 第三部分、單硝酸異山梨酯促進(jìn)血管發(fā)育的機(jī)制研究

15、r>　　 目的：經(jīng)過初步篩選后發(fā)現(xiàn)單硝酸異山梨酯具有明顯的促血管發(fā)生作用，本研究旨在探索其促進(jìn)血管新生的作用機(jī)制，探討參與藥物促血管發(fā)育過程中血管新生相關(guān)基因的變化。
　　 方法：1.使用短效、中效及長效硝酸酯類藥物配制成溶液后使用熒光顯微鏡觀察胚胎發(fā)育至26hpf節(jié)間血管的發(fā)育情況。2.提取斑馬魚整胚RNA，檢測(cè)血管新生相關(guān)基因VEGF及其受體fli1a、kdr1、flt4，PDGFR的相對(duì)表達(dá)量的變化。3.制備VEGFR的

16、探針，進(jìn)一步檢測(cè)藥物作用后斑馬魚血管發(fā)育情況。4.使用HUVEC細(xì)胞深入探討藥物效應(yīng)：使用MTT、流式細(xì)胞儀等檢測(cè)藥物作用于內(nèi)皮細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞活力的影響；檢測(cè)藥物作用于內(nèi)皮細(xì)胞后血管新生重要調(diào)節(jié)因子miR-126的表達(dá)變化。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，使用t檢驗(yàn)及方差分析組內(nèi)及組間差異，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：1.通過三種不同效果的硝酸酯類藥物作用于斑馬魚胚胎觀察血管發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)只有長效硝酸酯類-

17、單硝酸異山梨酯可明顯促進(jìn)斑馬魚節(jié)間血管發(fā)育，硝酸甘油、硝酸異山梨酯及單硝酸異山梨酯的節(jié)間血管長度分別為0.039±0.002mm；0.039±0.002mm；0.062±0.001mm，與對(duì)照組(0.040±0.001mm)相比，單硝酸異山梨酯的血管長度明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。單硝酸異山梨酯的作用時(shí)間只局限在26hpf，源于斑馬魚血管發(fā)育及生長特點(diǎn)，在藥物作用的20hpf及30hpf并未見血管促進(jìn)效應(yīng)。2.藥物作用于斑

18、馬魚胚胎后，斑馬魚整胚血管新生相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生變化。血管新生相關(guān)的VEGF及其受體kdr1在12hpf及24hpf的相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組增加，而可同時(shí)表達(dá)在內(nèi)皮及血細(xì)胞的fli1a及主要表達(dá)在靜脈的flt4并未出現(xiàn)明顯變化。與節(jié)間血管生長密切相關(guān)的另一基因PDGFR在24hpf的表達(dá)也較對(duì)照組增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3.藥物作用于HUVEC細(xì)胞后首先使用MTT檢測(cè)其細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)藥物處理組較對(duì)照組增加了48.20％。而通

19、過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藥物處理后的細(xì)胞凋亡明顯減少。4.提取HUVEC細(xì)胞RNA后檢測(cè)血管新生相關(guān)的miR-126，發(fā)現(xiàn)5個(gè)不同濃度的藥物處理組(500ug/ml，50ug/ml、5ug/ml、0.5ug/ml、0.05ug/ml)其表達(dá)量較對(duì)照組均明顯減少。
　　 結(jié)論：1.單硝酸異山梨酯可通過影響VEGF及VEGF受體發(fā)揮血管促進(jìn)作用，同時(shí)血管新生相關(guān)的PDGFR也在藥物效應(yīng)中發(fā)揮作用。2.單硝酸異山梨酯可增加內(nèi)皮細(xì)胞活力，并

20、通過降低miR-126的相對(duì)表達(dá)量發(fā)揮作用。3.單硝酸異山梨酯可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長，促進(jìn)血管新生，提示其有可能促進(jìn)冠狀動(dòng)脈血管再生及冠脈側(cè)支循環(huán)的建立。
　　 總結(jié)：本研究建立了斑馬魚藥物篩選平臺(tái)，并在其平臺(tái)上觀察了心血管系統(tǒng)常用藥物對(duì)斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響，為藥物作用于多靶點(diǎn)而產(chǎn)生綜合效應(yīng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。對(duì)篩選出影響血管系統(tǒng)再生的藥物進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，觀察到單硝酸異山梨酯為代表促進(jìn)血管新生的機(jī)制中存在VEGF及VEGF受體