斑馬魚生物鐘基因clock1a的功能研究.pdf

1、在自然界中所有生物都存在一種近似24小時的晝夜節(jié)律，稱為生物鐘。生物鐘在細胞、組織等水平上都具有調(diào)節(jié)作用。生物鐘紊亂會給身體帶來極大的危害，例如睡眠失調(diào)、代謝失調(diào)、衰老提前。
　　生物鐘的分子機制主要依賴一個細胞自主調(diào)控的轉(zhuǎn)錄翻譯反饋環(huán)路。該環(huán)路由一對正向調(diào)節(jié)因子和一對負向調(diào)節(jié)因子組成：CLOCK和BMAL形成異二聚體，結(jié)合到per和cry啟動子區(qū)域的E/E’-box來激活它們的轉(zhuǎn)錄。隨后，PER和CRY蛋白在細胞質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體

2、并進入細胞核內(nèi)，通過作用于CLOCK: BMAL異二聚體，從而反饋抑制其本身轉(zhuǎn)錄。
　　斑馬魚中存在clock基因的3個拷貝，它們在不同組織器官中轉(zhuǎn)錄振蕩。斑馬魚已經(jīng)演化出不同的clock基因表達機制，并且這三個基因的功能已經(jīng)出現(xiàn)了分化。但這三個clock基因的具體功能至今還不清楚。
　　本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功獲得了缺失7個堿基的斑馬魚clock1a突變體。熒光素酶報告實驗表明突變的clock1a不能激活e

3、4bp4-2b轉(zhuǎn)錄活性。實時定量PCR顯示，在純合 clock1a突變的斑馬魚幼體中，其反饋環(huán)路下游的生物鐘基因per1a、per1b、per2、per3、cry1aa、cry1ab、cry1ba、cry1bb表達在正常光暗和持續(xù)黑暗條件下都顯著改變。clock1a突變體斑馬魚幼魚在正常光暗條件下的運動振幅增加。而在連續(xù)黑暗的情況下，clock1a突變體斑馬魚則完全失去了節(jié)律。clock1a敲除斑馬魚幼魚的高活動量在成魚中也得到了證實。

4、實驗顯示在大部分時間點clock1a敲除斑馬魚成魚的活動量顯著高于同齡的野生型成魚。這些結(jié)果表明Clock1a在保持斑馬魚生物鐘的正常運轉(zhuǎn)中起到不可或缺的作用。
　　在鏡面攻擊試驗中，clock1a敲除斑馬魚成魚對于其自身影像更具有攻擊性。這些結(jié)果表明在斑馬魚中，clock1a敲除斑馬魚成魚也表現(xiàn)出躁狂癥相似的表型。Li+是一種精神穩(wěn)定藥物，常常用來治療躁狂癥。我們使用Li+來處理clock1a敲除斑馬魚幼魚，來驗證其是否能拯救該

5、魚的異常。實驗表明Li+能夠有效的使魚的行為恢復(fù)到正常的水平。這也揭示了clock1a在保持生物鐘系統(tǒng)的正常運轉(zhuǎn)及正常行為規(guī)律上的重要作用。
　　另外，clock1a敲除導(dǎo)致雌魚所產(chǎn)胚胎量大幅上升，其生殖相關(guān)基因lh、lhr、fsh、fshr及卵黃蛋白原基因vtg的表達上調(diào)，但體內(nèi)促黃體素、促卵泡素、雌激素含量并沒有受到影響。clock1a敲除對雄魚生殖沒有影響。
　　為了深入研究clock1a的調(diào)節(jié)功能，我們通過高通量轉(zhuǎn)錄

6、組測序檢測clock1a-/-突變體胚胎在ZT2（11:00,98hpf）和ZT14（23:00,110hpf）時的基因表達譜。與野生型相比，在ZT2時clock1a-/-突變體有244個基因上調(diào)，406個基因下調(diào)；而在ZT14時clock1a-/-突變體有184個基因上調(diào)，249個基因下調(diào)。并且clock1a-/-突變體在不同時間點的差異表達基因也不同，在clock1a-/-突變體中ZT2和ZT14時期有159個相同的差異表達基因。其

7、中凋亡蛋白酶相互作用蛋白Apip的表達水平下降了近7倍，分析該基因發(fā)現(xiàn)在其啟動子上存在經(jīng)典的E box元件。apip可能是clock1a的靶基因，這說明 clock1a參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)。另外，肌動蛋白結(jié)合蛋白anillin的表達也下調(diào)，說明clock1a也調(diào)節(jié)細胞的胞質(zhì)分裂。
　　本論文構(gòu)建了clock1a敲除斑馬魚，初步探索了clock1a敲除對其他核心生物鐘基因表達以及行為的影響，也揭示了生物鐘在行為、生理、生殖方面的作用。