短濱螺褐藻膠裂解酶(LbAly35)初級結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸和α—L一古羅糖醛酸通過β一1,4糖苷鍵連接形成的線形陰離子多糖。兩種糖醛酸隨機(jī)排列組合成聚甘露糖醛酸(Polymannumnate,M-block)、聚古羅糖醛酸(Polvgulumnate,G-block)或甘露糖醛酸和古羅糖醛酸交替嵌段(MG-block)。從海洋褐藻提取出的褐藻酸鈉水溶液具有較高的粘稠性,且褐藻酸的鈣鹽形成具有彈性的膠體,近年來,酶法降解褐藻膠產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)具有更多特定的生物學(xué)活性。作為可

2、將褐藻膠分解為褐藻寡糖的褐藻膠裂解酶吸引了食品和醫(yī)藥學(xué)者的廣泛關(guān)注,該酶廣泛分布于海洋褐藻、海洋和土壤細(xì)菌、海洋無脊椎動物以及綠藻病毒,可通過β-消除反應(yīng)降解褐藻膠。本試驗對短濱螺主要褐藻膠裂解酶 LbAly35的初級結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究分析,旨在豐富貝類褐藻膠裂解酶基礎(chǔ)資料,為海產(chǎn)動物褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)研究以及綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。
　　從短濱螺肝胰腺內(nèi)提取出三種褐藻膠裂解酶:LbAly28,LbAly32以及LbAly35。純化流程概

3、括如下:從180克短濱螺肝胰腺糜中提取粗酶,通過硫酸銨沉淀法從70％-90%濃度下分化得到較純的褐藻膠裂解酶,將上述沉淀利用10mM磷酸二氫鈉(PH=7.0)進(jìn)行溶解并過夜透析,將上述透析后的酶液利用陽離子交換柱層析(TOYOPEARL-CM650M)進(jìn)行純化,用等量10mM磷酸二氫鈉(PH=7.0)和0.3M氯化鈉進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫。純化后得到的LbAly28比活力為155.47 U/mg,純化倍數(shù)為16.54倍,回收率為1.63%;L

4、bAly32的比活力為286.47 U/mg,純化倍數(shù)為30.47倍,回收率為4.03%;LbAly35的比活力為143.48 U/mg,純化倍數(shù)為15.26倍,回收率為3.60%。酶活測試按照如下方法:溫度30℃下,含有0.12%褐藻酸鈉、50mM磷酸二氫鈉(PH=7.0)以及適量待測酶液的混合液,其中每毫升酶液每分鐘催化褐藻酸鈉裂解,使底物吸光值升高0.01為1個酶活單位。蛋白質(zhì)濃度測定主要采用雙縮脲法,利用結(jié)晶牛血清清蛋白(BSA

5、)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
　　通過 ABI492HT蛋白測序儀,LbAly28,LbAly32和LbAly35的N-末端氨基酸殘基被測定,其中 LbAly28的N端序列為:AGSELWRHTTFHSGS,LbAly32的N端序列為: ASGTELFRHTTFTTG，LbAly35的N端序列為:ASGTELFRHTTFTTGSIS。并與皺紋盤鮑褐藻膠裂解酶 HdAly的N-端氨基酸殘基序列進(jìn)行比對,旨在為短濱螺褐藻膠裂解酶基因的克隆提供序列

6、信息。
　　LbAly35的cDNA被成功克隆和分析以用獲得其初級結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息。試驗樣本采于日本北海道函館市七重浜海岸,短濱螺肝胰腺總RNA抽提試劑盒TaKaRa RNAiso Plus,mRNA利用Oligotex-dT(30) mRNA Purification Kit獲取,雙鏈cDNA合成所用試劑盒為cDNA Synthesis Kit。cDNA文庫建立后短濱螺褐藻膠裂解酶基因小片段cDNA1利用簡并引物成功擴(kuò)增,RACE

7、擴(kuò)增利用3’-Full RACE Kit以及5’-Full RACE Kit。擴(kuò)增產(chǎn)物利用PCR-TOPO2.1 TA Cloning Kit進(jìn)行克隆,ABI3130XL遺傳分析儀測定堿基序列。
　　LbAly35基因 cDNA序列全長1093bp,其中包括74bp的5′端非翻譯區(qū),128bp的3′端非翻譯區(qū)和編碼296個氨基酸殘基的891bp開放閱讀框,序列中存在翻譯起始密碼子 ATG、終止密碼子 TAG、N-端序列、加尾信號序

8、列 CATAA以及 poly A尾。中腹足目(Mesogastropoda)的短濱螺,其褐藻膠裂解酶 LbAly35的N-端氨基酸序列與皺紋盤鮑、角蠑螺的同源性分別只有15%和20%。不同軟體動物,特別是目與目之間褐藻膠裂解酶 N-端序列的高度差異性可能導(dǎo)致酶的生物活性的差異。短濱螺褐藻膠裂解酶 LbAly35與皺紋盤鮑褐藻膠裂解酶(胞內(nèi))HdAly,角蠑螺(T. cornutus)褐藻膠裂解酶 SP2,皺紋盤鮑褐藻膠裂解酶(胞外)Hd

9、Alex,黑斑海兔(Aplysia kurodai)褐藻膠裂解酶 AkAly30的序列相似為40%至48%,序列的高度相似性表明短濱螺褐藻膠裂解酶 LbAly35也是 PL-14家族的成員。五個重要的氨基酸位點在 LbAly35的氨基酸序列中共發(fā)現(xiàn)有四個保守:賴氨酸-100(K100),精氨酸-125(R125),酪氨酸-137(Y137)和酪氨酸-139(Y139),表明其具有和其它軟體動物褐藻膠裂解酶相似的催化位點。
　　由于

10、從氨基酸殘基推導(dǎo)出的LbAly35分子量為29.41kDa,小于從 SDS-PAGE估測值,其準(zhǔn)確的分子量利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜測得為33.6 kDa,兩種方法獲得的分子量差異可能與糖鏈修飾有關(guān)。在貝類褐藻膠裂解酶中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糖鏈修飾結(jié)合位點天冬酰胺-半胱氨酸-絲氨酸組合中的天冬酰胺,但是在相同的氨基酸位點,LbAly35和LbAly28顯示無此氨基酸組合。但是在 LbAly35的氨基酸序列另外2個區(qū)域,共發(fā)現(xiàn)2個可能為糖