海洋弧菌vibriosp.qy101褐藻膠裂解酶的研究

1、中國海洋大學(xué)博士學(xué)位論文海洋弧菌Vibrio sp.QY101褐藻膠裂解酶的研究姓名：宋凱申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：水產(chǎn)品加工與貯藏工程指導(dǎo)教師：于文功20040601V i b r i o ．s p ．Q Y 1 0 1 以褐藻膠培養(yǎng)基2 5 。C 發(fā)酵培養(yǎng)，使用8 0 ％硫酸銨沉淀發(fā)酵液上清中的蛋白質(zhì)，得到粗酶液；將粗酶液上樣于以2 0 m m o l ／Lp H 7 ．5 磷酸鹽緩沖液平衡的D E A E ．S e p h a r

2、o s eF a s tF l o w 柱，進(jìn)行離子交換層析， 以8 ．0g ／L 、1 8 ．0g I L 、以及5 8 ．Og ／L N a C l 濃度梯度洗脫，分部收集洗脫組分，紫外吸收法檢測(cè)酶活，發(fā)現(xiàn)酶活集中在1 8 ．0 g ／L 梯度處，大量收集活性組分；D E A E —S e p h a r o s eF a s tF l o w 純化得到的活性組分上樣于用2 0 m m o l ／Lp H 7 ．5 磷酸鹽緩沖液平衡

3、的S u p e r d e x 7 5H R 凝膠過濾柱，收集活性組分。S D S ．P A G E 電泳結(jié)果表明，得到的褐藻膠裂解酶已達(dá)到電泳純，分子量為3 9 k D ：酶反應(yīng)最適p H 為7 ．5 ，最適反應(yīng)溫度為3 0 ℃；N d 、C a ”、M n “對(duì)酶活性有促進(jìn)作用，F(xiàn) e “、N i ”以及E D T A 對(duì)酶活性有抑制作用。酶的底物?！苑治鼋Y(jié)果表明，該酶同時(shí)具有降解多聚古羅糖醛酸p o l y ( G ) 及多聚

4、甘露糖醛酸p o l y ( M ) 的活性。進(jìn)一步的研究表明，該酶對(duì)于細(xì)菌所產(chǎn)的乙?；衷迥z同樣具有降解作用，這一特性為迄今已發(fā)現(xiàn)的酶所不具有的。因此，該酶在降解細(xì)菌生物膜多糖、恢復(fù)其對(duì)抗生素的敏感性方面具有良好的應(yīng)用前景。在分離純化過程中，我們發(fā)現(xiàn)除了目的收集組分外，尚有一個(gè)小的組分有活性，但由于含量低，難以分離純化。在這種情況下，我們針對(duì)該組分更易降解p o l y ( G ) 的特性，根據(jù)已知的褐藻膠裂解酶基因的同源性設(shè)計(jì)引物，

5、使用簡并P C R 與反向P C R 技術(shù)從V i b r i o ．s p ．Q Y1 0 1 中克隆到一個(gè)褐藻膠裂解酶基因a l y V I 。基因序列分析發(fā)現(xiàn)a l y V I 由編碼3 3 8 個(gè)氨基酸的1 0 1 4 b p 的開放閱讀框組成，其編碼的蛋白分子量為3 8 ．4k D a ，其中包括分子量大約為4 ．4 k D a的一段信號(hào)肽。利用p E T 2 4 a ( + ) 建立了丑咖V 7 的高效表達(dá)載體，并使用N i

6、 ”親和柱分離得到A l y V I 。酶學(xué)性質(zhì)研究表明： A l y Y l 分子量約為3 4k D a ，在lm MZ n C l 。存在的情況下，A 1 y V I 的酶活最適溫度為4 0 ℃，最適p H 為7 ．5 。序列分析表明，A l y V I 含有“Y X R S E L R E M ”，這9 個(gè)氨基酸的保守序列僅僅存在于p o l y ( G ) 活性的褐藻膠裂解酶中。本實(shí)驗(yàn)中得到的A l y V I 同時(shí)具有p o