海洋弧菌復蘇促進因子家族糖蛋白酶的研究.pdf

1、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)廣泛分布于江湖河口及海洋環(huán)境,是引起水產動物疾病的條件性致病菌,副溶血弧菌也是引起人食物中毒的重要病原菌。副溶血弧菌和哈維氏弧菌在不良環(huán)境形成活的非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài),條件適宜時復蘇為可培養(yǎng)形式,引起動物疾病,但有關細菌復蘇的機制仍不清楚。藤黃微球菌細胞復蘇促進因子(Rpf)的發(fā)現是研究休眠菌復蘇機制的一個重大突破,微量的Rpf能

2、有效促進休眠微球菌的復蘇以及生活狀態(tài)細菌的增殖。有關弧菌細胞復蘇促進因子家族蛋白的結構與功能研究報道較少,本文對副溶血弧菌和哈維氏弧菌的Rpf家族的糖蛋白酶(Gcp)基因進行克隆、表達,并構建哈維氏弧菌gcp基因突變株,對表達Gcp生物學功能及突變株性質進行研究,為進一步探索海洋弧菌VBNC狀態(tài)的形成和復蘇機制奠定基礎。
　　 從副溶血弧菌、哈維氏弧菌基因組中克隆的gcp基因由702 bp組成,編碼233個氨基酸殘基的蛋白質,都

3、不含有明顯的信號肽和跨膜蛋白結構域。副溶血弧菌8621.4的Gcp與其他副溶血弧菌菌株、哈維氏弧菌、溶珊瑚弧菌、擬態(tài)弧菌、費氏弧菌、殺鮭弧菌等的糖蛋白酶的氨基酸序列相似性為67％-100％,與變形桿菌和沙門氏菌復蘇促進因子的相似性分別為55％和57％,與耶爾森氏菌的M22肽酶YeaZ的相似性為55％。哈維氏弧菌SF-1的Gcp序列與其他哈維氏弧菌菌株、溶藻膠弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶珊瑚弧菌、霍亂弧菌、梅氏弧菌和燦爛弧菌等糖蛋白酶的

4、氨基酸序列相似性分別為69％-98％,與大腸桿菌糖蛋白酶的序列相似性為58％-59％。
　　 將副溶血弧菌8621.4和哈維氏弧菌SF-1的gcp基因克隆于原核表達載體,在大腸桿菌中表達,采用Ni親和層析柱純化的Gcp為單一的蛋白帶。利用純化的副溶血弧菌8621.4表達Gcp免疫新西蘭大白兔制備特異性抗體,Western-blotting方法檢測發(fā)現正常生長的副溶血弧菌8621.4和哈維氏弧菌SF-1胞內表達Gcp蛋白,在培養(yǎng)上

5、清中檢測不到表達的Gcp,分子量約為27 kDa,與已報道其他細菌的Rpf分子量相近；VBNC狀態(tài)誘導過程中(低溫寡營養(yǎng))的副溶血弧菌8621.4和哈維氏弧菌SF-1菌體也能特異性表達該蛋白,而在VBNC狀態(tài)的副溶血弧菌菌體中檢測到2條特異表達蛋白帶,其中一條蛋白的分子量約為27 kDa,另一條蛋白的分子量約為54 kDa,推測其為Gep蛋白的二聚體。研究發(fā)現哈維氏弧菌SF-1表達的Gcp蛋白對正常生活狀態(tài)下SF-1的促生長作用非常顯著