海洋交替假單胞菌QY203的κ-卡拉膠酶研究.pdf

1、卡拉膠是由1,4-α-D-吡喃半乳糖和1,3-β-D.吡哺半乳糖作為基本骨架,交替連接而成的硫酸線性多糖。根據(jù)是否含有3,6-內(nèi)醚半乳糖結(jié)構(gòu)以及硫酸基的含量的不同,目前工業(yè)上生產(chǎn)和使用的卡拉膠主要為κ-型、τ-型和λ-型三種,其二糖單元分別含有1個(gè)、2個(gè)和3個(gè)硫酸基?？ɡz作為一種富含硫酸基的硫酸酯化多糖類物質(zhì),具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤、降血脂、免疫調(diào)節(jié)和抗凝血等生物活性。
　　卡拉膠降解酶是一種糖水解酶,通過斷裂卡拉膠的β-1,

2、4糖苷鍵降解卡拉膠?？ɡz降解酶的應(yīng)用十分廣泛,在糖水解酶家族研究、卡拉膠的結(jié)構(gòu)和功能解析、卡拉寡糖的工程化應(yīng)用以及體內(nèi)多糖代謝途徑研究等諸多方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值和理論研究意義。
　　本文通過富集培養(yǎng)等方法對(duì)海洋細(xì)菌進(jìn)行篩選,得到了能夠降解κ-.卡拉膠活性的海洋細(xì)菌35株。以活性最高的QY203作為出發(fā)菌株進(jìn)行了后續(xù)研究,通過對(duì)菌株QY203進(jìn)行16S rDNA種屬鑒定和進(jìn)化樹構(gòu)建,將該菌株歸屬于海洋交替假單胞菌。
　　從

3、其發(fā)酵上清中利用硫酸銨沉淀、疏水層析、離子交換層析等分離純化方法獲取了電泳純的K一卡拉膠酶(CgkP),從SDS-PAGE電泳結(jié)果中可知該酶分子量為34.0 kDa。分離純化CgkP回收率為26.9％,純酶的比活力高達(dá)1121.7 U/mg。利用純化出的CgkP進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究表明,該酶的最適反應(yīng)溫度為45℃,最適反應(yīng)pH為7.2。該酶在pH6.0-9.0時(shí)保持穩(wěn)定。該酶在45℃孵育1 h可保持80％的活性,在40℃孵育48 h可保存7

4、0％的活性。CgkP是一個(gè)具有良好溫度穩(wěn)定性的κ-卡拉膠酶。Na+能夠極大的促進(jìn)酶的活性,K+對(duì)酶活性也有促進(jìn)作用,而其他的金屬離子如:Ca2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、Zn2+等以及SDS、EDTA對(duì)酶活性均有不同程度的抑制作用。
　　通過簡并PCR和反向PCR得到一個(gè)卡拉膠酶基因序列,將獲取的全長基因序列和氨基酸序列分別進(jìn)行Blast比對(duì),發(fā)現(xiàn)該序列與來源于Pseudoalteromonasgalactanivorans

5、 ATCC43555的κ-卡拉膠降解酶基因序列cgkA相似度最高為95％,Pseudoalteromonas tetraodonis中產(chǎn)的卡拉膠降解酶k142基因序列相似度為90％,氨基酸相似度分別為97％和95％。而將該基因進(jìn)行歸屬時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因序列與糖苷水解酶第16家族保守區(qū)相似度最高,因此我們將該卡拉膠酶CgkX歸類于第16家族。
　　酶解κ-卡拉膠獲取降解終產(chǎn)物,用P6柱分離純化,并且將純化的組分進(jìn)行TLC分析,并用質(zhì)譜法進(jìn)

6、行鑒定,可知酶解后最終產(chǎn)物為硫酸新κ-卡拉二糖和硫酸新κ-卡拉四糖;用酶法降解不同時(shí)間之后底物粘度的變化和酶活性的變化關(guān)系確定了CgkP對(duì)κ-卡拉膠的降解方式為內(nèi)切。
　　綜上所述,本文從青島膠州灣海域海泥中分離得到一株高效降解κ-卡拉膠的菌株P(guān)seudoalteromonas sp.QY203,該菌株具有較高的活性和良好的遺傳穩(wěn)定性。通過對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng),從其發(fā)酵上清中純化出了對(duì)κ-卡拉膠有專一性降解活性的κ-卡拉膠酶(CgkP),