靶向EGFRvIII并包裹液態(tài)氟碳高分子納米球的制備及其性質(zhì)研究.pdf

1、目的：
　　制備以EGFRvIII為靶點(diǎn)，EGFRvIII的單抗4G1為靶向分子的靶向高分子納米超聲造影劑，并對(duì)其性質(zhì)及體外靶向能力進(jìn)行研究。
　　第一部分表皮生長(zhǎng)因子受體突變體III（EGFRvIII）單抗4G1的特異性驗(yàn)證
　　方法：
　　培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞F98EGFR（EGFR+/EGFRvIII-）和F98npEGFRvIII（EGFR-/EGFRvIII+），對(duì)細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫印跡（WB）實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證抗體4

2、G1對(duì)EFGRvIII蛋白的特異性；對(duì)F98EGFR和F98npEGFRvIII細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)（FCM）和免疫熒光（IF）實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證抗體4G1與EFGRvIII陽性細(xì)胞的特異性結(jié)合；氯胺T法制備131I-4G1，以探究抗體4G1與細(xì)胞穩(wěn)定結(jié)合的最佳時(shí)間。
　　結(jié)果：
　　4G1與F98npEGFRvIII細(xì)胞蛋白結(jié)合出現(xiàn)免疫印跡條帶，而不與F98EGFR細(xì)胞蛋白結(jié)合出現(xiàn)免疫印跡條帶；4G1與F98npEGFRvIII細(xì)胞

3、的結(jié)合率為（90.84±0.56）%，與F98EGFR細(xì)胞的結(jié)合率僅為（2.90±0.07）%；熒光顯微鏡下，F(xiàn)98npEGFRvIII細(xì)胞的胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞膜呈綠色熒光，F(xiàn)98EGFR僅有胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞膜外無綠色熒光；氯胺 T法制備的13lI-4G1在30 min、60 min、120 min、240 min和480 min時(shí)與F98npEGFRvIII細(xì)胞的結(jié)合率分別為（39.45±0.06）%、（49.19±0.48）%、（69

4、.64±0.19）%、（59.19±0.63）%和（55.79±0.69）%，與F98EGFR細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的結(jié)合率分別為（2.91±0.21）%、(2.97±0.75)%、(2.95±0.65)%、（2.96±0.43）%和（3.02±0.50）%。
　　結(jié)論：
　　單抗4G1僅能夠特異性地識(shí)別EGFRvIII陽性細(xì)胞蛋白，13lI-4G1僅與EGFRvIII陽性的F98npEGFRvIII細(xì)胞特異性結(jié)合，且在120 m

5、in時(shí)與F98npEGFRvIII細(xì)胞的結(jié)合率最高。
　　第二部分?jǐn)yEGFRvIII抗體4G1的PLGA納米球的制備及其性質(zhì)研究
　　方法：
　　采用雙乳化溶劑揮發(fā)法制備包裹液態(tài)氟碳的高分子納米球（P-NPs）；碳二亞胺法（EDC/NHS）偶聯(lián)P-NPs與4G1抗體，獲得靶向EGFRvIII的高分子納米球P-NPs-4G1；光鏡和掃描電鏡下觀察P-NPs-4G1的形態(tài)及分布特征；激光粒徑儀檢測(cè)P-NPs-4G1的粒徑及

6、Zeta電位；流式細(xì)胞術(shù)與激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)P-NPs與4G1的偶聯(lián)情況；倒置熒光顯微鏡下觀察熱作用致P-NPs-4G1相變前后情況；超聲診斷儀檢測(cè)P-NPs-4G1在體外經(jīng)低強(qiáng)度聚焦超聲（LIFU）輻照致相變前后情況；流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)P-NPs-4G1在體外與腫瘤細(xì)胞的靶向結(jié)合情況；在裸鼠腫瘤模型上，檢測(cè)P-NPs-4G1在體內(nèi)的靶向超聲顯像情況。
　　結(jié)果：
　　所制備的P-NPs-4G1納米球外觀呈乳

7、懸液狀；光鏡下形態(tài)規(guī)則，呈球形；電鏡下呈球形或類球形，表面光滑，形態(tài)規(guī)則；粒徑儀測(cè)得P-NPs-4G1的平均粒徑為（563.8±60.3）nm，表面電位（-32.4±3.37）mV；P-NPs與4G1的連接率為（97.37±1.57）%；P-NPs-4G1體外經(jīng)熱作用后可發(fā)生明顯的液氣相轉(zhuǎn)變產(chǎn)生微氣泡；經(jīng)LIFU輻照后發(fā)生相變而產(chǎn)生微氣泡，超聲波診斷儀檢測(cè)超聲顯像效果增強(qiáng)；在體外靶向?qū)嶒?yàn)中證實(shí)P-NPs-4G1可與EGFRvIII陽性的

8、F98npEGFRvⅢ（EGFR-/EGFRvIII+）細(xì)胞特異性結(jié)合，而不與EGFR陽性的F98EGFR（EGFR+/EGFRvIII-）細(xì)胞結(jié)合；在裸鼠腫瘤模型上，P-NPs-4G1經(jīng)尾靜脈注射、LIFU輻照后的體內(nèi)超聲顯像未得到理想的結(jié)果。
　　結(jié)論：
　　本研究成功制備出能夠特異性靶向EGFRvIII并包裹液態(tài)氟碳的高分子納米球P-NPs-4G1，其性質(zhì)穩(wěn)定，在體外經(jīng)聲熱作用后可發(fā)生液氣相轉(zhuǎn)變，增強(qiáng)超聲顯像效果，在體