對蝦腸道菌群動態(tài)平衡的免疫調(diào)控研究.pdf

1、對蝦養(yǎng)殖業(yè)是我國沿海地區(qū)重要的支柱產(chǎn)業(yè)。自上世紀(jì)90年代以來，對蝦養(yǎng)殖中疾病頻發(fā)，使對蝦養(yǎng)殖業(yè)屢受重創(chuàng)。為了解決困擾對蝦養(yǎng)殖業(yè)的疾病問題，科技工作者圍繞著宿主（對蝦的免疫防御）、病原（包括病原檢測、致病機(jī)理及防治）和環(huán)境（養(yǎng)殖環(huán)境的控制）三個方面做了大量的工作，也取得了很大的進(jìn)展。但疾病防治的問題始終沒有很好地解決，養(yǎng)殖中會不斷出現(xiàn)新的疾病。如果將宿主-病原-環(huán)境三個方面整合起來研究，有望發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖中疾病防控的新策略。對蝦腸道菌群的功能及

2、其動態(tài)平衡調(diào)控的研究是將三者聯(lián)系起來的一個橋梁，因為對蝦腸道菌群既與宿主免疫有關(guān)，又與環(huán)境有關(guān)。因此，以日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)為材料，對腸道菌群動態(tài)平衡的調(diào)控進(jìn)行了研究。
　　1.日本囊對蝦雙氧化酶參與腸道微生物群落動態(tài)平衡調(diào)控的研究
　　腸道先天免疫反應(yīng)是抵抗外來病原的一種重要的防御機(jī)制。在果蠅的研究中，已知活性氧ROS和抗菌肽在清除腸道病原體中起到重要作用。然而，甲殼動物是怎樣維持腸道

3、菌群平衡的，現(xiàn)在還不清楚。我們在日本囊對蝦(M.japonicus)中克隆鑒定了一種雙氧化酶，命名為MjDUOX2。MjDUOX2是一種跨膜蛋白，N端在細(xì)胞外，含有一個19個氨基酸的信號肽和一個554個氨基酸的過氧化酶同源結(jié)構(gòu)域(Peroxidase homology domain，PHD);有7個跨膜域;細(xì)胞內(nèi)的部分含有3個EF結(jié)構(gòu)域（鈣離子結(jié)合域），一個104氨基酸的黃素腺嘌呤二核甘酸(Flavinadenine dinucleot

4、ide，F(xiàn)AD)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個156氨基酸的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。MjDUOX2和已報道的日本囊對蝦中的DUOX(命名為MjDUOX1)有較低的相似度(26.84％)。
　　檢測兩種MjDUOX在日本囊對蝦中的組織分布，發(fā)現(xiàn)MjDUOXs的mRNA廣泛表達(dá)于血細(xì)胞、心臟、肝胰腺、鰓、胃和腸中。經(jīng)口感染弧菌后，腸道中MjDUOXs上調(diào)表達(dá)，且活

5、性氧(ROS)水平升高。通過RNA干擾(RNA interference，RNAi)的方法敲低MjDUOXs基因的表達(dá)，腸道中ROS水平下降，細(xì)菌數(shù)量升高。利用RNA干擾技術(shù)敲降MjDUOXs的表達(dá)并感染病原菌后，對蝦存活率明顯下降。上述結(jié)果表明，能夠產(chǎn)生ROS的MjDUOXs在對蝦腸道菌群的動態(tài)平衡調(diào)控中發(fā)揮重要作用。
　　2.日本囊對蝦過氧化氫酶降低活性氧ROS水平并參與腸道微生物的穩(wěn)態(tài)調(diào)控
　　活性氧包括過氧化物、超氧

6、陰離子和羥自由基等。作為一種強氧化劑，具有廣泛殺滅微生物作用，包括細(xì)菌、病毒和真菌等。近年來研究也發(fā)現(xiàn)活性氧在細(xì)胞的增生、分化、凋亡等的調(diào)控中也起重要作用，被認(rèn)為是一種新的第二信使。同時過量的活性氧也可以引發(fā)生物大分子及生物組織的氧化損傷。前面的研究發(fā)現(xiàn)DUOX可以在腸道細(xì)菌刺激的情況下產(chǎn)生活性氧，但對蝦腸道中多余的活性氧是如何清除還不了解。本研究中，我們從日本囊對蝦中克隆得到的一種過氧化氫酶(Catalase，CAT)，并命名為MjC

7、AT。利用半定量PCR方法檢測MjCAT的組織分布，結(jié)果顯示其mRNA在血細(xì)胞、心臟、肝胰腺、鰓、胃和腸中都有表達(dá)。經(jīng)口感染病原菌-弧菌后，腸道中MjCAT的表達(dá)量上調(diào)，酶活性升高，ROS含量在短時間內(nèi)上調(diào)并很快恢復(fù)。當(dāng)用RNAi方法將MjCAT基因表達(dá)敲低后發(fā)現(xiàn)，ROS水平升高，并能保持較長時間。同時，對蝦腸道內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量與對照組相比明顯降低。干擾MjCAT并感染病原菌，對蝦存活率也顯著降低。觀察MjCAT干擾后對蝦腸道的組織結(jié)構(gòu)，發(fā)

8、現(xiàn)腸腔中絨毛受到損傷。這些結(jié)果表明，MjCAT可以調(diào)節(jié)腸道中ROS水平并調(diào)控宿主腸道與微生物間的穩(wěn)態(tài)。
　　3.腸道菌群的識別與動態(tài)平衡調(diào)控的分子機(jī)理
　　在果蠅的研究中，DUOX在保持腸道微生物動態(tài)平衡過程中起到重要作用。但是宿主如何識別腸道菌群、并激活下游腸道菌群調(diào)控的信號途徑還不清楚。本研究中，我們首先對通過轉(zhuǎn)錄組測序得到的5種G-蛋白偶聯(lián)受體(Guanosine-bindingProtein Coupled Rece

9、ptor, GPCR)進(jìn)行了篩選，得到了一種與MjDUOXs表達(dá)相關(guān)的GPCR，根據(jù)其結(jié)構(gòu)域組成命名MjMeGPCR。MjMeGPCR的表達(dá)進(jìn)行RNA干擾，顯示MjDUOXs的表達(dá)量減少，且ROS水平降低;過表達(dá)MjMeGPCR，MjDUOXs的表達(dá)量升高，且ROS含量升高。另外，MjMeGPCR可以與多種細(xì)菌結(jié)合。我們還對該信號途徑下游的分子包括活化轉(zhuǎn)錄因子-2(Activating transcription factor-2,AT

10、F2)和有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK) p38(Mjp38)進(jìn)行了研究。當(dāng)抑制細(xì)胞質(zhì)中Ca2+回流入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時，ROS水平升高;當(dāng)抑制信號通路中的Mjp38活性或干擾MjATF2時，DUOX的表達(dá)量降低，ROS含量也降低。上述結(jié)果表明，腸道菌可以被MjMeGPCR所識別，通過p38和ATF2調(diào)控MjDUOXs的表達(dá)。此外并使Ca2+釋放，調(diào)控MjDUOXs的表達(dá)和活性，