兩頭尖抗肝纖維化作用及機理研究.pdf

1、第一部分兩頭尖總皂苷部位提取最佳工藝研究及制備
　　 目的：確定兩頭尖總皂苷部位提取最佳工藝，為后續(xù)藥理實驗提供所需實驗藥品。
　　 方法：采用竹節(jié)香附素A為對照品，以香草醛-冰醋酸法測定藥材中總皂苷的含量，以兩頭尖總皂苷的提取率為指標(biāo)，對回流、超聲和微波三種提取方法進行比較，并采取正交實驗法對提取工藝進行改進，確定3個因素，即乙醇濃度(A)、提取時間(B)及溶媒比(C)，每因素設(shè)計3個水平，用L9(34)正交表進行實驗

2、。
　　 結(jié)果：回流、超聲和微波三種提取方法的總皂苷提取率分別為2.30％、2.39％、3.69％。方差分析結(jié)果表明，A因素選1水平，B因素，C因素對結(jié)果變化無顯著性影響。
　　 結(jié)論：確定兩頭尖總皂苷最佳提取方法為，首先乙醚脫脂，接著乙醇微波提取，確定最佳條件為60％乙醇，10倍量，微波提取8min，30s為一個間隔；最后通過水飽和正丁醇萃取法進一步精制。本次實驗用兩頭尖總皂苷得率為2.66％。
　　 第二部分

3、兩頭尖抗豬血清免疫大鼠肝纖維化模型的作用及機理研究
　　 目的：觀察兩頭尖原藥及兩頭尖提取物對豬血清免疫誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠的治療作用，旨在從組織病理、HSC活化、細胞因子、細胞外基質(zhì)變化等方面考察其療效并進而探討其作用機制。
　　 方法： SD大鼠68只隨機分為5組，即空白組、模型組、扶正化瘀組(以下簡稱扶正組)、兩頭尖原藥組(以下簡稱原藥組)、兩頭尖提取物組(以下簡稱提取組)。采用豬血清腹腔注射法制備大鼠肝纖維化模

4、型，0.5ml/只，每周2次，連續(xù)注射15周。第15周模型成功后，開始灌胃給藥，扶正組給予扶正化瘀膠囊(15.8g·kg-1)，原藥組給予兩頭尖煎液(0.7g·kg-1)，提取物給予兩頭尖提取物(0.071g·kg-1)，模型組與空白組灌服等量生理鹽水，日一次，療程8周。實驗過程中，定期稱重并記錄，觀察記錄動物行為學(xué)特征，記錄死亡情況。大鼠于第23周末處死取材，分光光度法測定血清ALT、AST、ALB、SOD、MDA含量與肝組織中羥脯氨

5、酸(Hyp)含量。ELISA法檢測血清中MMP-9含量；放免法檢測血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ含量；胍染色與Masson法檢測肝組織病理；免疫組化法(SABC法)測定肝組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)表達；RT-PCR技術(shù)測定肝組織中基質(zhì)金屬蛋白抑制酶-1(TIMP-1)mRNA表達。
　　 結(jié)果：與模型組相比，扶正組、原藥組、提取物組可顯著改善大鼠一般身體狀況，且

6、體重變化有顯著差異(p<0.05)；HE染色與masson染色結(jié)果證實，模型組大鼠肝組織正常肝小葉結(jié)構(gòu)完全被破壞，肝索排列紊亂，在匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)有大量纖維結(jié)締組織增生沉積，增多的膠原纖維形成線條狀纖維間隔，可見假小葉形成。部分肝細胞出現(xiàn)萎縮、腫脹變性，甚至點狀壞死，匯管區(qū)擴大，炎性細胞及壞死細胞增多。與模型組相比，扶正組、提取組、原藥組炎癥活動度、纖維化程度顯著減輕(p<0.05)。免疫組化結(jié)果表明，模型組肝組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α

7、-SMA、TGF-β1多呈高水平表達，染色呈深褐色，面積彌漫；扶正組、原藥組、提取組表達面積和強度較模型組明顯為弱，纖維間隔染色淡，無典型假小葉形成。顯色指數(shù)結(jié)果表明，與模型組相比，扶正組、提取組、原藥組肝組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA、TGF-β1的表達均明顯減少(p<0.05)，且原藥組α-SMA表達輕于扶正組(p<0.05)。模型組血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ、MDA含量與肝組織Hyp含量明顯升高(p<0.0

8、5)，血清Alb、SOD、MMP-9含量明顯降低(p<0.05)。與模型組相比，除提取組LN，扶正組與提取組血清SOD含量差異無顯著性外，扶正組、原藥組、提取組血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ、MDA含量與肝組織Hyp含量下降(P<0.05)，Alb、SOD、MMP-9含量升高(P<0.05)。肝組織中TIMP-1mRNA表達結(jié)果表明，模型組肝組織中TIMP-1mRNA表達增高(p<0.05)；與模型組相比，提取組肝組織中T

9、IMP-1mRNA表達降低(p<0.05)。
　　 結(jié)論：采用豬血清免疫法可成功制備肝纖維化大鼠模型，兩頭尖原藥及其提取物具有良好的抗肝纖維化作用，且提取物抗肝纖維化作用基本等同于兩頭尖原藥。推測其作用機制為：①抑制肝星狀細胞活化；②抑制ECM合成并促進ECM降解；③抑制促纖維化細胞因子表達；④保護肝細胞、減輕肝臟炎癥；⑤抗脂質(zhì)過氧化損傷
　　 第三部分兩頭尖含藥血清對人肝星狀細胞LX-2增殖及Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-S

10、MA、TGF-β1表達的影響
　　 目的：觀察兩頭尖含藥血清對人肝星狀細胞增殖的影響并進而探討其作用機理。
　　 方法： MTT比色法觀測兩頭尖含藥血清對人肝星狀細胞LX-2增殖的影響；應(yīng)用細胞免疫組化法觀察兩頭尖對人肝星狀細胞中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA、TGF-β1表達的影響。
　　 結(jié)果：無論是兩頭尖原藥或是兩頭尖提取物含藥血清均對人肝星狀細胞增殖具有抑制作用，隨著濃度的增加，對LX-2增值的抑制作用也