微流控和單細(xì)胞分選技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：近年來(lái)，隨著微流控技術(shù)和二代測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，微流控芯片在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣，而單細(xì)胞分析也引起了越來(lái)越多的關(guān)注。本文首先開(kāi)發(fā)了一種用于體外抗高血壓藥物評(píng)估的仿真微流控芯片裝置；其次，鑒于現(xiàn)有的分離單細(xì)胞技術(shù)的不足，建立一種鑒定、富集和挑選單細(xì)胞的系統(tǒng)。
　　方法：（1）①用軟光刻技術(shù)以PDMS為材料制作出內(nèi)部管道尺寸為長(zhǎng)4 cm、寬2 mm、高100μm的PDMS-玻璃微流控芯片。芯片用FN在37℃包被1 h，

2、在芯片上種入HUVECs并培養(yǎng)；②利用一個(gè)微流注射泵、一個(gè)注射器、一個(gè)數(shù)字壓力計(jì)、接頭和軟管與芯片搭建為一套微流控芯片加壓系統(tǒng)，通過(guò)微流注射泵設(shè)置流速，數(shù)字壓力計(jì)顯示壓力，給芯片內(nèi)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞施加合適的壓力；③實(shí)驗(yàn)時(shí)，在壓力為0 KPa、12 KPa、18 KPa下，分別通入藥物濃度分別為0，50，250，500μmo l/L的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分兩組：第一組加壓時(shí)和加壓后都對(duì)細(xì)胞給藥，第二組只在加壓后對(duì)細(xì)胞給藥.微流控芯片放入培養(yǎng)箱中，加

3、壓系統(tǒng)其它部分則留在外面；④加壓后收集加壓過(guò)程和加壓之后的培養(yǎng)液，做ELIS A用于檢測(cè)ET-1釋放，用鼠抗人CD62P抗體和羊抗鼠Alexa Fluor546二抗、Alexa Fluor488 phalloidin、DAPI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，把芯片置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。（2）①計(jì)算機(jī)作為整個(gè)系統(tǒng)的控制中樞，三軸電缸作為384孔板液體自動(dòng)分配器，顯微操作儀控制毛細(xì)玻璃針的位置，顯微注射泵控制細(xì)胞的吸吐，顯微鏡用于拍照和實(shí)時(shí)顯示。②用

4、C++編寫(xiě)程序控制系統(tǒng)各個(gè)部件，生成第一步384孔板和第二步玻璃微坑操作的圖形用戶界面；③為了實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的高效富集，用兩個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)富集和挑選功能：第一步，使用384孔板對(duì)樣品進(jìn)行初篩：樣品經(jīng)預(yù)處理后制備成細(xì)胞懸液，平均分配到384孔板中，顯微鏡下對(duì)孔板每個(gè)孔依次成像，用軟件輔助判斷目標(biāo)細(xì)胞所在的孔，并將孔中所有細(xì)胞收集；第二步：將第一步收集的細(xì)胞平鋪到玻璃微坑上，對(duì)整個(gè)細(xì)胞液滴進(jìn)行成像，軟件輔助判斷目標(biāo)細(xì)胞在液滴中所在位置，通過(guò)顯微操作

5、儀和顯微注射泵控制玻璃針，將目標(biāo)細(xì)胞吸入，并吐出細(xì)胞至載玻片上的油滴里；④為了檢驗(yàn)系統(tǒng)挑細(xì)胞的效率，將轉(zhuǎn)染了RFP熒光蛋白的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231摻入到乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的摻雜樣品作為實(shí)驗(yàn)樣品。設(shè)置五組實(shí)驗(yàn)，分別將1個(gè)、2個(gè)、5個(gè)、10個(gè)和20個(gè)MDA-MB-231-RFP細(xì)胞摻入100萬(wàn)個(gè)MCF-7細(xì)胞中，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。將小鼠肝癌腫瘤組織作為樣品，經(jīng)組織消化后制備成單細(xì)胞懸液，在系統(tǒng)上挑取單個(gè)肝癌細(xì)胞，用全基因組、轉(zhuǎn)

6、錄組和單細(xì)胞甲基化方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增、建立文庫(kù)并用Illumina Hiseq2500高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。
　　結(jié)果：（1）①使用微流注射泵、電子壓力計(jì)、微流控芯片、接頭盒軟管所搭建加壓系統(tǒng)可用于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞對(duì)壓力和藥物的響應(yīng)；②細(xì)胞Alexa Fluor488 phalloidin、DAPI染色結(jié)果表明壓力越大，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架被破壞，隨著加入藥物濃度的增加，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白微絲重新排列；③細(xì)胞CD62P和DAPI染色結(jié)果表

7、明壓力增加，刺激細(xì)胞分泌P選擇素，藥物濃度增加，P選擇素分泌減少；④ET-1檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明，內(nèi)皮細(xì)胞釋放ET-1隨著壓力的增加而增加，隨著藥物濃度增加而減少。（2）①所搭建的挑細(xì)胞系統(tǒng)可在程序控制下正常工作；②384孔板和第二步玻璃微坑操作的圖形用戶界面可輔助實(shí)驗(yàn)圖像識(shí)別，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)保存以及實(shí)時(shí)顯示功能；③摻雜實(shí)驗(yàn)表明系統(tǒng)挑取單細(xì)胞效率可達(dá)60％以上；④小鼠腫瘤細(xì)胞樣品實(shí)驗(yàn)表明系統(tǒng)可挑取組織消化后單細(xì)胞樣品并成功用于全基因組、轉(zhuǎn)錄組和甲基化