白木香結(jié)香前后內(nèi)生菌的多樣性分析.pdf

1、目的：白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg，又稱土沉香、女兒香，來源于瑞香科沉香屬。白木香是我國傳統(tǒng)中藥沉香的唯一源植物，已經(jīng)被列為國家二級(jí)瀕危保護(hù)植物。國產(chǎn)沉香是白木香受物理化學(xué)的損傷或某些生物的刺激而產(chǎn)生的含樹脂的木材，是傳統(tǒng)名貴中藥材和天然香料，具有很高的藥用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值，但其自然積累過程需要漫長的數(shù)十年，且品質(zhì)不可控。沉香形成過程及其結(jié)香機(jī)制至今尚未完全研究透徹，導(dǎo)致實(shí)際生產(chǎn)中尚無高效優(yōu)質(zhì)的人工結(jié)

2、香手段，同時(shí)源植物資源一直被掠奪式開發(fā)，因此市場上沉香供不應(yīng)求、價(jià)格居高不下。已有不少研究證實(shí)沉香的形成與內(nèi)生菌的感染有關(guān)，但其研究思路都是依托實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法。本研究采用分子生物學(xué)方法，PCR-變性梯度凝膠電泳即PCR-DGGE(Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)技術(shù)，以及末端限制性片段長度多樣性即T-RFLP（Terminal-restriction fragment len

3、gth polymorphism， T-RFLP）技術(shù)對比白木香未結(jié)香白木及結(jié)香部位內(nèi)生菌的菌落結(jié)構(gòu)及多樣性，探討內(nèi)生菌對白木香結(jié)香的影響，為開發(fā)更多更好的促進(jìn)結(jié)香的微生物提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：⑴為了避免外源性微生物的污染，用已消毒的生長錐去掉取材部位的表層，取材后迅速放入已滅菌的采集袋，運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室-20℃保存?zhèn)溆?。⑵將各個(gè)樣品在超凈臺(tái)表面消毒后無菌環(huán)境晾干。用滅菌刀片刮去樣品表層組織，以防止外源性微生物DNA的污染，保證提

4、取的核酸來自植物組織內(nèi)部;同時(shí)剃除結(jié)香組樣品連帶的健康白木部分，保證結(jié)香組提取的微生物DNA來源于沉香。將處理好的樣品無菌環(huán)境液氮研末，置于無菌離心管備用。⑶各樣品總DNA提取采用植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行，具體操作參考按試劑盒使用說明。⑷提取的總DNA點(diǎn)樣于1％的瓊脂糖凝膠，電泳檢測其片段大小，并用核酸蛋白儀測定DNA的濃度及質(zhì)量。⑸以樣品總DNA（稀釋液）為模板，擴(kuò)增引物都采用通用引物，且上游引物帶上GC夾，PCR完成后，產(chǎn)物1

5、.5％瓊脂糖凝膠檢測，合格后進(jìn)行DGGE電泳，掃描凝膠得到DGGE圖譜，合格后選取條帶編號(hào)割膠回收，回收條帶擴(kuò)增產(chǎn)物直接送檢測序。⑹以樣品總DNA（稀釋液）為模板，分別采用帶有FAM熒光基團(tuán)的細(xì)菌和真菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收后膠回收試劑盒進(jìn)行純化。純化后的PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物委托上海基康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行熒光掃描。
　　結(jié)果：無論是結(jié)香組還是未結(jié)香組，DGGE都分離得