蛋白質(zhì)組學(xué)和分子生物學(xué)在HCMV感染致病機(jī)制的應(yīng)用研究.pdf

1、目的: 1.應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染導(dǎo)致臨床個(gè)體致肝炎綜合征血清學(xué)和HCMV感染相關(guān)細(xì)胞的神經(jīng)瘤細(xì)胞內(nèi)、外液蛋白質(zhì)組學(xué)差異表達(dá)，建立與HCMV致病相關(guān)的蛋白標(biāo)志物篩選方法； 2.建立可調(diào)控的針對(duì)HCMV即刻早期基因的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，并檢測(cè)即刻早期基因?qū)?xì)胞抗凋亡的影響，以此探討可能的機(jī)理。 材料和方法： 1.取臨床HCMV引起的先天性嬰兒肝炎綜合征(Congenita

2、l human cytomegalovirus hepatitis)患兒20例作為實(shí)驗(yàn)組，三個(gè)對(duì)照組25例血清標(biāo)本(肝功能情況檢測(cè)、CMV特異性IgM抗體及尿CMV基因定量檢測(cè))，分離并制備蛋白，與WCX2蛋白質(zhì)芯片相互作用，利用SEIDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)液中分子量在5000-20000Da范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，繪制出蛋白飛行質(zhì)譜，在Biomarker Wizard軟件的輔助下，分析差異蛋白。根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)，在

3、Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)差異蛋白進(jìn)行初步鑒定。 2.選擇人星型膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251細(xì)胞)和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)，按細(xì)胞數(shù)量之比為10:1的比例將兩種細(xì)胞混合培養(yǎng)，感染HCMVAD169株。病毒感染神經(jīng)瘤細(xì)胞6h后，RT-PCR的方法檢測(cè)HCMV IE基因的表達(dá)水平。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀察HCMV感染對(duì)神經(jīng)瘤細(xì)胞凋亡的影響；體外培養(yǎng)U251，細(xì)胞，細(xì)胞感染病毒后不同時(shí)間段收獲細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)收獲正常細(xì)胞為對(duì)照組，使

4、用基于SELDI技術(shù)的時(shí)間.飛行質(zhì)譜儀和WCX2芯片，檢測(cè)各組之間細(xì)胞內(nèi)、外液蛋白表達(dá)譜的差異。將各組蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行比較，并將相關(guān)蛋白峰在Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，尋找與病毒的感染及發(fā)病相關(guān)的蛋白分子。 3.利用已有質(zhì)粒pIE72，設(shè)計(jì)人巨細(xì)胞病毒HCMV即刻早期基因IE1的特異性引物，進(jìn)行IE1基因的擴(kuò)增、提純、鑒定，構(gòu)建重組的可調(diào)控真核表達(dá)載體pTRE2-hyg/IE1，純化質(zhì)粒。 4.常規(guī)培養(yǎng)Tet-On HeL

5、a細(xì)胞，以陽(yáng)離子高效轉(zhuǎn)染試劑HifectinⅡ轉(zhuǎn)染細(xì)胞。首先在培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)報(bào)道基因，在普通熒光顯微鏡下觀察顯示綠色熒光的HeLa細(xì)胞，確定轉(zhuǎn)染效率；在轉(zhuǎn)染EGFP基因的基礎(chǔ)上，體外常規(guī)培養(yǎng)Tet-On HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pTRE2-hyg/IE1重組質(zhì)粒，經(jīng)G418和潮霉素雙重篩選，RT-PCR和Western Blot和免疫

6、組織化學(xué)方法鑒定IE1的表達(dá)。 5.終濃度為100ng/mL的腫瘤壞死因子a作用于HeLa細(xì)胞，建立HeLa細(xì)胞的凋亡曲線；不同終濃度的Doxcycline(0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL)作用轉(zhuǎn)染pTRE2-hyg/IE1的HeLa細(xì)胞，誘導(dǎo)IE1表達(dá)，RT-PCR方法檢測(cè)IE1基因的產(chǎn)生，Western blot檢測(cè)IE1蛋白的產(chǎn)生水平，MTT法檢測(cè)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞增值率。 結(jié)果： 1.HC

7、MV引起的先天性嬰兒肝炎綜合征組與各對(duì)照組比較，血清中有4個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，在Swiss蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到分子量為5811.6Da、7935.6Da和8899.3Da的蛋白峰分別與β-防御素8、巨噬細(xì)胞源性趨化因子和血小板堿性蛋白在分子量和等電點(diǎn)上非常接近。 2.HCMV感染的兩個(gè)組與無(wú)HCMV感染的兩組嬰兒比較，血清中共有5個(gè)蛋自質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，其中5639.0Da、5909.6Da、7776.5Da和15

8、833.2Da的蛋白峰分別與促胸腺生成素、β淀粉樣前體蛋白A4、血小板因子4和白細(xì)胞介素-25在分子量和等電點(diǎn)上非常接近。 3.HCMV隱性感染組與其他組比較，血清中有2個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，5710.7Da的蛋自峰與β-防御素31非常接近。 4.兩個(gè)先天性嬰兒肝炎綜合征組與肝功能正常的另兩組嬰兒比較，血清中有4個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，其中7567.6Da、13744.1Da、15092.8Da、15931

9、.6Da的蛋白峰分別與巨噬細(xì)胞炎性蛋白4、前白蛋白、肝再生增強(qiáng)因子和結(jié)合珠蛋白非常接近。 5.RT-PCR的方法檢測(cè)HCMV IE基因的表達(dá)用于證實(shí)HCMV感染，成功建立了神經(jīng)瘤細(xì)胞的HCMV感染模型。病毒感染1天后細(xì)胞無(wú)明顯變化，感染3天后細(xì)胞在G1峰左側(cè)出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體細(xì)胞群的峰(亞G1峰，即凋亡峰)，感染5天后細(xì)胞凋亡峰明顯。 6.病毒感染后細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡明顯增加。感染后3天和6天的

10、細(xì)胞凋亡率分別為4.1％和42.6％。與正常對(duì)照組比較，分子量為2631.6Da、12027Da和13536.3Da的蛋白峰在病毒感染后表達(dá)持續(xù)上調(diào)，HCMV感染后4h略有增高，病毒感染后48h明顯升高。通過(guò)在Swiss數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索發(fā)現(xiàn)其蛋白峰的分子量和等電點(diǎn)分別與Caspase-1、TNF-a、β淀粉樣前體蛋白非常接近。 7.構(gòu)建的真核表達(dá)載體pTRE2-hyg/IE1序列測(cè)定正確。Dox調(diào)控的重組表達(dá)載體pTRE2-hyg/

11、IE1體外轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，經(jīng)G418和潮霉素B雙重篩選，獲得一株穩(wěn)定表達(dá)IE1的HeLa細(xì)胞株。梯度濃度的Doxcycline(0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL)作用pTRE2-hyg/IE1-HeLa細(xì)胞48h，RT-PCR檢測(cè)Dox誘導(dǎo)表達(dá)的mRNA比值IE1/β-actin分別為0.733，0.917和1.768，western blot檢測(cè)IE1蛋白，IE1/β-actin分別為1.32，5.83和7.07。

12、 8.終濃度為100μg/mL的TNF-a和25μg/mL的ACTD聯(lián)合作用于轉(zhuǎn)染IE1質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞后，MTT檢測(cè)HeLa細(xì)胞增值率顯示轉(zhuǎn)染IE1的細(xì)胞在8h之內(nèi)細(xì)胞活性大于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，caspACE檢測(cè)caspase-3表達(dá)量分別為0.6±0.029、1.6±0.04.1和1.85±0.065，而未轉(zhuǎn)染IE1的HeLa細(xì)胞caspase-3表達(dá)量分別為0.85±0.061、2.6±0.058和4.5±0.065。統(tǒng)計(jì)學(xué)分

13、析各組比值差異有顯著意義(P<0.01)，從而證明轉(zhuǎn)染后的IE1-HeLa細(xì)胞具有顯著抗凋亡功能，細(xì)胞學(xué)觀察也證實(shí)這一點(diǎn)。 結(jié)論： 1.建立了HCMV感染引起的先天性嬰兒肝炎綜合征人群的血清蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和HCMV感染神經(jīng)瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)、外液差異蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，并發(fā)現(xiàn)了HCMV臨床個(gè)體及細(xì)胞學(xué)改變的有意義的蛋白質(zhì)組學(xué)指標(biāo)。 2.HCMV感染過(guò)程持續(xù)增高的細(xì)胞蛋自因子，可能與HCMV感染所產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡有關(guān)。