白藜蘆醇對球囊損傷血管PAPP-A表達(dá)影響及機(jī)制研究.pdf

1、第一章:PAPP-A在大鼠頸動脈球囊損傷后的表達(dá)及白藜蘆醇干預(yù)作用 目的：制作大鼠頸動脈球囊拉傷模型，觀察大鼠頸總動脈球囊損傷后血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增生反應(yīng)，血漿TNF-a水平的改變，血管壁表達(dá)PAPP-A水平及其與血管內(nèi)膜增殖的關(guān)系，以及白藜蘆醇（Resveratrol，Res）對其的影響，為臨床血管成形術(shù)后再狹窄的預(yù)防和治療提供新的思路。 方法：72只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（shame group）

2、，手術(shù)組（operation group）和干預(yù)組（intervention group），每組各24只。干預(yù)組于手術(shù)前一周及術(shù)后灌胃給白藜蘆醇50mg/kg/天，余兩組用等量生理鹽水。采用頸中切口，假手術(shù)組單行血管分離，手術(shù)組及干預(yù)組行頸總動脈球囊拉傷術(shù)。術(shù)后1、7和14天，每組各處死大鼠8只。經(jīng)左室抽血5ml，靜止后離心3000轉(zhuǎn)/分，10min，離心后獲得的血漿置于-20℃冰箱備用。隨后剪開右心室，經(jīng)左心室用4%多聚甲醛灌注，采用

3、頸中切口取出左頸總動脈1.5cm左右，放入4%甲醛液中固定24小時，常規(guī)制成蠟塊；擬行RT-PCR頸動脈標(biāo)本直接獲取后迅速放入凍存管中，轉(zhuǎn)移到液氮中保存?zhèn)溆?。觀察頸總動脈形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行形態(tài)學(xué)參數(shù)測量：外、內(nèi)彈力板包繞面積、管腔面積，中膜面積并計算新生內(nèi)膜面積、新生內(nèi)膜面積/中膜面積比值（IA/MA）、及管腔狹窄指數(shù)（管腔面積/內(nèi)彈力板包繞面積），并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血漿TNF-a水平，免疫組織化學(xué)檢測血

4、管壁增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測血管管壁中妊娠相關(guān)血漿蛋白-A（PAPP-A）的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1.1天時，光鏡下假手術(shù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)彈力板完整，手術(shù)組及干預(yù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞消失，有時內(nèi)彈力板撕裂。7天時時，手術(shù)組及干預(yù)組可見明顯的內(nèi)膜增生，增生的血管平滑肌細(xì)胞排列比較紊亂，進(jìn)入管腔，使管腔面積減??；14d時，手術(shù)組及干預(yù)組內(nèi)膜增生進(jìn)一步加重，程度不一，增生細(xì)胞排列明顯

5、紊亂，使管腔明顯狹窄。 2.血管形態(tài)學(xué)參數(shù)的結(jié)果：與假手術(shù)組比手術(shù)組和干預(yù)組7和14d時，外、內(nèi)彈力板包繞面積，中膜面積無顯著差異（P>0.05）。管腔面積、IA/MA、管腔狹窄指數(shù)有顯著改變（P<0.01）；7天及14天時與手術(shù)組比較，干預(yù)組管腔面積（LA）擴(kuò)大（P<0.01），新生內(nèi)膜面積/中膜面積（IA/MA）顯著減小，管腔狹窄指標(biāo)顯著減?。≒<0.01）； 3.血漿TNF-a水平：對照組血漿中TNF-α在1天、7

6、天及14天時間的變化差異性不顯著，無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。手術(shù)組血漿中TNF-α在1天時到達(dá)高峰（P<0.01），7天時有顯著降低，但仍然較對照組明顯升高（P<0.01），14天時恢復(fù)正常水平；干預(yù)組血漿中TNF-α水平在1天時顯著升高，但較手術(shù)組顯著降低（P<0.01），7天時較手術(shù)組顯著降低（P<0.01），和正常組無顯著差異（P>0.05）。14天時，血漿TNF-a水平較7天時進(jìn)一步降低（P=0.025）和正常水平無顯著區(qū)別

7、（P>0.05）。 4.血管壁PCNA表達(dá)：假手術(shù)組血管內(nèi)膜未見明顯PCNA陽性表達(dá)，中膜可見少量表達(dá)，手術(shù)組與藥物治療組中1d中膜可見少量PCNA表達(dá)，7d時血管中膜、新生內(nèi)膜可見大量表達(dá)，手術(shù)組較干預(yù)組顯著增多（P<0.01）；14d時兩組中膜、新生內(nèi)膜表達(dá)減少；與手術(shù)組比較干預(yù)組PCNA陽性表達(dá)較手術(shù)組顯著減少（P<0.01）。 5.血管壁PAPP-A mRNA的表達(dá)：假手術(shù)組低水平表達(dá)PAPP-A mRNA，損傷

8、7d后，手術(shù)組PAPP-A mRNA有明顯表達(dá)且較干預(yù)組顯著升高（23.63±0.49 VS12.88±0.43，P<0.01），損傷14d后手術(shù)組及干干預(yù)組血管壁中PAPP-AmRNA表達(dá)量進(jìn)一步增加，與藥物治療組比較手術(shù)組的PAPP-AmRNA表達(dá)量顯著升高（42.62±0.59 VS29.69±0.36，P<0.01）。 結(jié)論： 1.單純球囊拉傷建立大鼠頸總動脈內(nèi)膜增生模型方便、可靠。 2.血漿中TNF-a

9、、血管壁組織PAPP-AmRNA，PCNA在球囊損傷后2周內(nèi)血管壁有-顯著表達(dá)，在急性損傷期內(nèi)的水平與血管壁的增生程度相關(guān)。 3.白藜蘆醇能顯著降低血漿TNF-a水平，抑制血管壁PAPP-AmRNA，PCNA的表達(dá)、能減輕新生血管內(nèi)膜的增生，擴(kuò)大管腔面積。 第二章:TNF-a對VSMCs PAPP-A表達(dá)、細(xì)胞周期影響及白藜蘆醇干預(yù)作用 目的：采用復(fù)合膠原酶解離法進(jìn)行大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，為心血管疾病

10、血管平滑肌細(xì)胞的體外研究提供簡單，高純度的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法；觀察腫瘤壞死因子-a（TNF-a）對大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）妊娠相關(guān)蛋白-A（PAPP-A）mRNA的表達(dá)、細(xì)胞周期及增殖活力的影響，及白藜蘆醇（Res）的干預(yù)作用，探討白藜蘆醇抗血管平滑肌增殖的可能作用機(jī)制。為臨床研究抗血管成形術(shù)后再狹窄的治療靶點(diǎn)選擇提供理論依據(jù)。 方法：采用Wistar大鼠腹主動脈，利用復(fù)合膠原酶解離法進(jìn)行大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞的原代

11、培養(yǎng)，利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)及平滑肌細(xì)胞a-actin染色，鑒定血管平滑肌細(xì)胞的純度；將細(xì)胞傳代到4～6代后行干預(yù)實(shí)驗(yàn)：（一）1）將細(xì)胞分組：空白對照組單純給予10%的DMEM培養(yǎng)基；TNF-a刺激組TNF-a刺激組以10ng/mL濃度刺激1、4、8、24h，2）將細(xì)胞分組：空白對照組單純給予10%的DMEM培養(yǎng)基；TNF-a刺激組以10-1，100，101，102 ng/mL濃度的TNF-a刺激VSMCs8h。觀察不同濃度的TNF-a對PAP

12、P-A mRNA表達(dá)的影響。3）將細(xì)胞分組：空白對照組單純給予10%的DMEM培養(yǎng)基；TNF-a刺激組以10ng/mL的TNF-a濃度刺激；白藜蘆醇干預(yù)組用不同濃度（10-8～10-4 mol/L）的白藜蘆醇預(yù)處理6h后，再用10 ng/mL TNF-a刺激8h。觀察白藜蘆醇對TNF-a誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞PAPP-AmRNA表達(dá)的影響。（二）1）將細(xì)胞分為空白對照組、TNF-a刺激組（10-1～10210ng/mL）、白藜蘆醇組（10-

13、8～10-4 mol/L）、自藜蘆醇干預(yù)組（10-8～10-4 mol/LRes+10ngTNF-a）作用24h，觀察TNF-a、Res對血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響及白藜蘆醇對TNF-a影響細(xì)胞周期的干預(yù)作用。（三）將細(xì)胞分為空白對照組、TNF-a刺激組及白藜蘆醇干預(yù)組（10-8～10-4 mol/LRes+10ng/mlTNF-a）作用4天，MMT法檢測細(xì)胞的增殖活力，觀察TNF-a對細(xì)胞增殖活力的影響及白藜蘆醇的干預(yù)作用。

14、 結(jié)果： 1.0.2%Ⅰ型膠原酶和0.2%Ⅱ型膠原酶混合能充分裂解動脈血管，細(xì)胞受損傷輕，接種成功率高；一周左右細(xì)胞就能生長到進(jìn)行細(xì)胞傳代的亞融合狀態(tài)。再次進(jìn)行傳代的時間大約是3～5天。傳代后大約90%的細(xì)胞可重新貼壁生長。傳代后的細(xì)胞更多的表現(xiàn)為“峰-谷”樣生長方式；第3代爬片SMC的免疫組化顯示血管平滑肌的純度可達(dá)到96%以上。 2.在不同時間段內(nèi)TNT-a對血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)PAPP-AmRNA的影響：血管平滑肌細(xì)

15、胞在1h時PAPP-AmRNA即有顯著增加（P<0.01），在8小時PAPP-AmRNA表達(dá)量達(dá)到高峰，并與各組間亦有顯著差異（P<0.01）。 3.不同濃度的TNT-a對血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)PAPP-AmRNA表達(dá)的影響：基礎(chǔ)狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞PAPP-AmRNA無明顯表達(dá)，在10-1ng/mL時PAPP-AmRNA顯著表達(dá)（P=0.016），并呈劑量依賴性表達(dá)增加，并在10ng/ml達(dá)到高峰，組間比亦有顯著差異（P<0.0

16、1）。 4.白藜蘆醇對TNT-a影響平滑肌細(xì)胞PAPP-AmRNA表達(dá)的干預(yù)實(shí)驗(yàn)：在10-8mol/L濃度時對TNT-a誘導(dǎo)的血管平滑肌PAPP-A的表達(dá)無顯著影響（P=0.148），在10-6、10-4mol/L濃度范圍內(nèi)，白藜蘆醇濃度依賴性的顯著抑制TNT-a誘導(dǎo)的血管平滑肌PAPP-AmRNA的表達(dá)（P<0.01）。 5.不同濃度的TNT-a對血管平滑肌細(xì)胞周期的作用：10-1ng/mL濃度的TNF-a對細(xì)胞周期無

17、顯著影響，與空白組比較（P>0.05）；在100～102ng/mL的濃度范圍內(nèi)TNT-a使細(xì)胞S期、G2/M期數(shù)目百分比增加，G0/G1期數(shù)目百分比降低，與空白組比較有顯著性差異（P<0.01），并在TNT-a10ng/mL時達(dá)到最高。 結(jié)論： 1.復(fù)合膠原酶解離法進(jìn)行大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)是一種簡單，高純度的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法。 2. TNF-a呈時間、濃度依賴性的刺激血管平滑肌細(xì)胞PAPP-AmRNA